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GFP-Tubulin 表达问题

GFP-Tubulin 表达问题# Biology - 生物学

t*t2015-10-20 07:10

1 楼

房贷是怎么影响信用分数的？信贷比怎么算？

w*12015-10-20 07:10

2 楼

最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端，一个在N端，测序看读码框啥的都没问题。但问题也来了，EYFP在
Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
EYFP的信号特别特别弱。换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
cytosolic without a sniff of a tubule。请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
？谢谢啦。

c*72015-10-20 07:10

3 楼

买房后，可以马上申请了。。。。

s*y2015-10-20 07:10

4 楼

可能是你的linker 设计得不够长。
我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。进入微管结构刚刚的。

【在 w*********1 的大作中提到】

: 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
: 观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
: sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
: 自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
: Tubulin C 端，一个在N端，测序看读码框啥的都没问题。但问题也来了，EYFP在
: Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
: EYFP的信号特别特别弱。换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
: 后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
: cytosolic without a sniff of a tubule。请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
: ？谢谢啦。

t*t2015-10-20 07:10

5 楼

为啥？那我申不到可找你要包子。

【在 c*********7 的大作中提到】

: 买房后，可以马上申请了。。。。

t*52015-10-20 07:10

6 楼

这个Linker好像不是常规设计用到的？

【在 s******y 的大作中提到】

: 可能是你的linker 设计得不够长。
: 我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。进入微管结构刚刚的。

S*t2015-10-20 07:10

7 楼

correct

【在 c*********7 的大作中提到】

: 买房后，可以马上申请了。。。。

C*42015-10-20 07:10

8 楼

Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
FULLLENGTH FUSION PROTEIN。

u*n2015-10-20 07:10

9 楼

why？

w*12015-10-20 07:10

10 楼

学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？

【在 C*******4 的大作中提到】

: Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
: FULLLENGTH FUSION PROTEIN。

b*x2015-10-20 07:10

11 楼

问一下， hard inquiry 要多久没影响。
我刚借了construction loan。估计8-9月后要转normal loan。
现在申卡有影响吗，现在是780左右，有construction loan后，分数会跳上去吗？

b*e2015-10-20 07:10

12 楼

linker 越 flexible越好。常规的话，GSSGSS repeat就行。

：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？

h*a2015-10-20 07:10

13 楼

我房子close后马上在一个月内申了5张卡。全批了。

【在 t****t 的大作中提到】

: 房贷是怎么影响信用分数的？信贷比怎么算？

C*42015-10-20 07:10

14 楼

第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因，所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker，Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到：]
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？
：...........

S*t2015-10-20 07:10

15 楼

hand, I got 5 too after closing.

【在 h****a 的大作中提到】

: 我房子close后马上在一个月内申了5张卡。全批了。

m*y2015-10-20 07:10

16 楼

这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染，效果还不错，Linker5个氨基酸，
Tubulin的第一个M去掉了

z*62015-10-20 07:10

17 楼

但是买完以后不是会有巨大债务产生没?怎么会都批准?
还是等账单出来前申请?

w*12015-10-20 07:10

18 楼

请问您可以看到在interphase的filament以及在mitosis的spindle么？我构建的GFP-
Tubulin绿色荧光超强，可就是看不到丝状结构。看上去也不是GFP，因为在间期里细胞
核没有绿色，绿色都在细胞质里面，但是就是diffuse在细胞质里，不形成微管结构，
这个让我很惆怅。

【在 m***y 的大作中提到】

: 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染，效果还不错，Linker5个氨基酸，
: Tubulin的第一个M去掉了

S*t2015-10-20 07:10

19 楼

要的就是时间差。
房子close后要过一个多月房贷才会到creditreport，至少我的是过了差不多两个月。
我在这期间申了5张，都拿到了。现在贷款到report了，score 少了20点，也许暂时
不能申了。

【在 z******6 的大作中提到】

: 但是买完以后不是会有巨大债务产生没?怎么会都批准?
: 还是等账单出来前申请?