w*1
2 楼
最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒,转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了,
自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在
Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之
后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
?谢谢啦。
观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了,
自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在
Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之
后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
?谢谢啦。
c*7
3 楼
买房后,可以马上申请了。。。。
s*y
4 楼
可能是你的linker 设计得不够长。
我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
【在 w*********1 的大作中提到】
: 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒,转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
: 观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
: sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了,
: 自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
: Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在
: Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是
: EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之
: 后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是
: cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
: ?谢谢啦。
我构建过类似的construct,用起来没有任何问题。 进入微管结构刚刚的。
【在 w*********1 的大作中提到】
: 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒,转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
: 观的,但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
: sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题,就自己找模板构建载体了,
: 自己构建了两个载体,一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
: Tubulin C 端,一个在N端, 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了,EYFP在
: Tubulin C端的(Tubulin-EYFP)质粒表达效率特别低,虽然转染效率还可以,就是
: EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的(EYFP-Tubulin)质粒转染Hela之
: 后,效率倒是相当之后,荧光强度也超赞,但是和人家给我的质粒问题一样,都是
: cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
: ?谢谢啦。
C*4
8 楼
Linker和TUBULIN上的Met都要考虑。最好去除第二个MET。可以跑个电泳看看是不是
FULLLENGTH FUSION PROTEIN。
FULLLENGTH FUSION PROTEIN。
u*n
9 楼
why?
b*x
11 楼
问一下, hard inquiry 要多久没影响。
我刚借了construction loan。 估计8-9月后要转normal loan。
现在申卡有影响吗, 现在是780左右, 有construction loan后, 分数会跳上去吗?
我刚借了construction loan。 估计8-9月后要转normal loan。
现在申卡有影响吗, 现在是780左右, 有construction loan后, 分数会跳上去吗?
b*e
12 楼
linker 越 flexible越好。常规的话,GSSGSS repeat就行。
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
C*4
14 楼
第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因,所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker,Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到:]
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
:...........
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker,Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到:]
:学习了,还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么?linker序列有特别要
:求么?Met指C端最后的那个氨基酸么?
:...........
m*y
16 楼
这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染,效果还不错,Linker5个氨基酸,
Tubulin的第一个M去掉了
Tubulin的第一个M去掉了
z*6
17 楼
但是买完以后不是会有巨大债务产生没?怎么会都批准?
还是等账单出来前申请?
还是等账单出来前申请?
r*g
20 楼
我买房后半年已经5张了
Y*o
21 楼
有点小影响,但是不大,看人品.
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