韩春雨的NgAgo效率怎么样？有人试过么？# Biology - 生物学
e*r
1 楼
我记得哺乳动物细胞瞬转CRISPR敲除基因经常有80-90%的切割效率，基本上转染进去的
细胞就会被切
韩春雨这个能到这么高吗？有没有人试过？
细胞就会被切
韩春雨这个能到这么高吗？有没有人试过？
f*r
2 楼
Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
.
.
c*i
3 楼
我记得thermofisher的人说直接用蛋白转可能到90%。
cells
【在 f******r 的大作中提到】
: Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
: .
cells
【在 f******r 的大作中提到】
: Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
: .
l*s
4 楼
Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
cells
【在 f******r 的大作中提到】
: Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
: .
率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
cells
【在 f******r 的大作中提到】
: Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
: .
s*i
5 楼
我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
【在 l***s 的大作中提到】
: Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
: 率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
:
: cells
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
【在 l***s 的大作中提到】
: Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
: 率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
:
: cells
l*s
6 楼
你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
泡泡。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
: oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
: 题。
: 质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
: 也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
泡泡。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
: oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
: 题。
: 质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
: 也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
c*6
7 楼
Keep my fingers crossed
【在 l***s 的大作中提到】
: 你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
: 系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
: 泡泡。
【在 l***s 的大作中提到】
: 你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
: 系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
: 泡泡。
r*s
8 楼
我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
r*s
9 楼
如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
r*s
10 楼
如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
r*s
11 楼
如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。
l*s
12 楼
进细胞核可能有难度，不知效率怎样。
【在 r********s 的大作中提到】
: 如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
: [在 laghs (微小) 的大作中提到：]
: :你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: :protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
: 的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
: 大泡泡。
【在 r********s 的大作中提到】
: 如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
: [在 laghs (微小) 的大作中提到：]
: :你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: :protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
: 的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
: 大泡泡。
s*i
13 楼
我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
多了
里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
SV40NLS
我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
韩paper里的G10，下周再试一次
如果有结果我会post 出来的。
【在 l***s 的大作中提到】
: 你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
: 系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
: 泡泡。
转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
多了
里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
SV40NLS
我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
韩paper里的G10，下周再试一次
如果有结果我会post 出来的。
【在 l***s 的大作中提到】
: 你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
: protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
: 系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
: 泡泡。
l*s
14 楼
期待你的分享，谢谢。
序列
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
: 转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: 多了
: 里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: SV40NLS
: 我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
: 韩paper里的G10，下周再试一次
: 如果有结果我会post 出来的。
序列
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
: 转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: 多了
: 里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: SV40NLS
: 我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
: 韩paper里的G10，下周再试一次
: 如果有结果我会post 出来的。
r*s
15 楼
刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
r*s
16 楼
刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
序列
:转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
:多了
:里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
:SV40NLS
:我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
了韩paper里的G10，下周再试一次
:如果有结果我会post 出来的。
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。
s*i
17 楼
多谢！我不觉得那几个氨基酸会很重要，但是还是会买来试试看
我的蛋白序列跟他的一样，但是DNA序列是codon optimize过的
【在 r********s 的大作中提到】
: 刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
: [在 samalli (小米) 的大作中提到：]
: :我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
: 序列
: :转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: :多了
: :里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: :SV40NLS
: :我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
: 了韩paper里的G10，下周再试一次
我的蛋白序列跟他的一样，但是DNA序列是codon optimize过的
【在 r********s 的大作中提到】
: 刚刚看到Addgene已经有他们的质粒了，发现c-terminus多出几个氨基酸。
: [在 samalli (小米) 的大作中提到：]
: :我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位
: 序列
: :转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: :多了
: :里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: :SV40NLS
: :我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定
: 了韩paper里的G10，下周再试一次
k*n
18 楼
Oligo是不是很快被降解，需要重复转OLIGO？
k*n
19 楼
Cas9在我们系统里最高几乎百分百。
z*8
20 楼
cells
cas9效率的确大概在90％ 左右，我试了好几个cell lines。
你达不到90％最主要原因是feng zhang的那个plasmid太大，太难转进细胞。但是只要
转进去，效率正常90％。
【在 f******r 的大作中提到】
: Are you serious? Cas9 will never reach 80,90% in transient transfected cells
: .
K*R
21 楼
问楼上朋友们，一个问题，你们说的cas9转染效率，是说的病毒， 还是就是转染试剂？
能达到80 90
能达到80 90
f*r
22 楼
Hi, I agree. For transient transfection, Cas9 never reached 80,90% in HEK293
. And the efficiency is much worse in stem cells. But I guess the Virus-
based delivery will greatly increase the gene editing efficiency.
. And the efficiency is much worse in stem cells. But I guess the Virus-
based delivery will greatly increase the gene editing efficiency.
z*8
23 楼
剂？
不是转染效率，是切割效率。
【在 K**R 的大作中提到】
: 问楼上朋友们，一个问题，你们说的cas9转染效率，是说的病毒， 还是就是转染试剂？
: 能达到80 90
N*n
24 楼
除了效率，我觉得off target会是一个大问题。
【在 l***s 的大作中提到】
: Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
: 率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
:
: cells
【在 l***s 的大作中提到】
: Cas9还是很高效的，选好gRNA，80%以上还是非常可能的。NgAgo目前最大的担心就是效
: 率远赶不上Cas9。我们实验室也在试NgAgo，希望很快会有结论。
:
: cells
s*i
25 楼
I don't think this is true.
The efficiency is really cell line - dependent.
I recently had targeted mouse ES cells with HR events over 40%.
HEK293
【在 f******r 的大作中提到】
: Hi, I agree. For transient transfection, Cas9 never reached 80,90% in HEK293
: . And the efficiency is much worse in stem cells. But I guess the Virus-
: based delivery will greatly increase the gene editing efficiency.
The efficiency is really cell line - dependent.
I recently had targeted mouse ES cells with HR events over 40%.
HEK293
【在 f******r 的大作中提到】
: Hi, I agree. For transient transfection, Cas9 never reached 80,90% in HEK293
: . And the efficiency is much worse in stem cells. But I guess the Virus-
: based delivery will greatly increase the gene editing efficiency.
s*i
26 楼
又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
功，我们分别独立设计的质粒
质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
全一样
用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
常牛的mirus x2
转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
拿到了韩放到 addgene的质粒
下周再试一次
【在 e**r 的大作中提到】
: 我记得哺乳动物细胞瞬转CRISPR敲除基因经常有80-90%的切割效率，基本上转染进去的
: 细胞就会被切
: 韩春雨这个能到这么高吗？有没有人试过？
功，我们分别独立设计的质粒
质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
全一样
用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
常牛的mirus x2
转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
拿到了韩放到 addgene的质粒
下周再试一次
【在 e**r 的大作中提到】
: 我记得哺乳动物细胞瞬转CRISPR敲除基因经常有80-90%的切割效率，基本上转染进去的
: 细胞就会被切
: 韩春雨这个能到这么高吗？有没有人试过？
j*u
27 楼
求结果，我们实验室想打一只transgenic NgAgo老鼠
l*s
28 楼
多谢分享！看来和想象中的不一样啊。。。我们也拿到了Addgene的plasmid,同时自己
也建立了一个plasmid，准备下周一起试一下。但我觉得结果恐怕也不乐观啊。另外韩
的plasmid C-terminus多了7个氨基酸，不是说会影响结构吗？
DNA非
【在 s*****i 的大作中提到】
: 又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
: 功，我们分别独立设计的质粒
: 质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
: 全一样
: 用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
: 常牛的mirus x2
: 转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
: 拿到了韩放到 addgene的质粒
: 下周再试一次
也建立了一个plasmid，准备下周一起试一下。但我觉得结果恐怕也不乐观啊。另外韩
的plasmid C-terminus多了7个氨基酸，不是说会影响结构吗？
DNA非
【在 s*****i 的大作中提到】
: 又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
: 功，我们分别独立设计的质粒
: 质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
: 全一样
: 用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
: 常牛的mirus x2
: 转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
: 拿到了韩放到 addgene的质粒
: 下周再试一次
r*s
29 楼
我用自己克隆的两次都没成功，包括他们的GATA4 POSITIVE CONTROL。说不定这多出来
的7个AA能够成功 ？
【在 l***s 的大作中提到】
: 多谢分享！看来和想象中的不一样啊。。。我们也拿到了Addgene的plasmid,同时自己
: 也建立了一个plasmid，准备下周一起试一下。但我觉得结果恐怕也不乐观啊。另外韩
: 的plasmid C-terminus多了7个氨基酸，不是说会影响结构吗？
:
: DNA非
的7个AA能够成功 ？
【在 l***s 的大作中提到】
: 多谢分享！看来和想象中的不一样啊。。。我们也拿到了Addgene的plasmid,同时自己
: 也建立了一个plasmid，准备下周一起试一下。但我觉得结果恐怕也不乐观啊。另外韩
: 的plasmid C-terminus多了7个氨基酸，不是说会影响结构吗？
:
: DNA非
c*6
30 楼
还有人有重复的结果了吗
z*q
31 楼
你好，请问楼主做出来了？
我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 多谢！我不觉得那几个氨基酸会很重要，但是还是会买来试试看
: 我的蛋白序列跟他的一样，但是DNA序列是codon optimize过的
我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 多谢！我不觉得那几个氨基酸会很重要，但是还是会买来试试看
: 我的蛋白序列跟他的一样，但是DNA序列是codon optimize过的
z*q
32 楼
你好，请问楼主做出来了？
我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
序列
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
: 转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: 多了
: 里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: SV40NLS
: 我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
: 韩paper里的G10，下周再试一次
: 如果有结果我会post 出来的。
我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
序列
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用的gene block，N端加了3xFlag和nucleoplasmin NLS，就是张峰的Cas9的核定位序列
: 转293也试了韩paper里面targeting GFP的5pssDNA，也没做出来，也许GFP质粒转的太
: 多了
: 里面很多不确定因素，我已经做了一个跟韩的paper里完全一样的设计，N端Flag-
: SV40NLS
: 我也怀疑我的ssDNA 也许local公司磷酸化的不好。我有自己磷酸化的，并且从IDT定了
: 韩paper里的G10，下周再试一次
: 如果有结果我会post 出来的。
s*i
33 楼
我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
【在 z*******q 的大作中提到】
: 你好，请问楼主做出来了？
: 我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
: 了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
: 重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
:
: 序列
如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
【在 z*******q 的大作中提到】
: 你好，请问楼主做出来了？
: 我们也很关心！之前的版本我们没有重复出来，我们按照他paper里的氨基酸序列进行
: 了人源化密码子优化，也没有能重复出阳性的结果，几个合作比较紧密的实验室也没有
: 重复出来。如果关键点在这里的话，我很想知道结果。
:
: 序列
f*t
34 楼
国内做这个圈子也不大的。
目前为止我没听到任何有人能重复出类似他文章里fig.4的结果。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
目前为止我没听到任何有人能重复出类似他文章里fig.4的结果。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
z*q
35 楼
我们目前暂时没有找到任何一家国内的实验室做出了他的fig.4,并且有测序结果的。之
前据说有一个北大的实验室做了果蝇，但是貌似后面也没信了。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
前据说有一个北大的实验室做了果蝇，但是貌似后面也没信了。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
c*6
36 楼
目前也没有任何一家国外的实验室重复出来
【在 z*******q 的大作中提到】
: 我们目前暂时没有找到任何一家国内的实验室做出了他的fig.4,并且有测序结果的。之
: 前据说有一个北大的实验室做了果蝇，但是貌似后面也没信了。
【在 z*******q 的大作中提到】
: 我们目前暂时没有找到任何一家国内的实验室做出了他的fig.4,并且有测序结果的。之
: 前据说有一个北大的实验室做了果蝇，但是貌似后面也没信了。
C*5
37 楼
不知道大家发现没有，HAN文章里的质粒与ADDGENE里是不一样的。
对于Supplementary Figure 4第一张图，想知道他是用的什么抗体。
因为ADDGENE 里面的NLS-NGAGO质粒是没有标签的。
而且文章里面说nls-ngago质粒的骨架是pcDNA3.1，但是ADDGENE里面的骨架是pEGFP-N1
。
对于Supplementary Figure 4第一张图，想知道他是用的什么抗体。
因为ADDGENE 里面的NLS-NGAGO质粒是没有标签的。
而且文章里面说nls-ngago质粒的骨架是pcDNA3.1，但是ADDGENE里面的骨架是pEGFP-N1
。
C*5
38 楼
我试了2次，没做出来。293里面G10.
第一次是共转质粒和G10，48小时收样品。
第二次是先共转质粒和G10，然后24小时在转了一次个G10.
第一次是共转质粒和G10，48小时收样品。
第二次是先共转质粒和G10，然后24小时在转了一次个G10.
Q*e
39 楼
据隔壁某薄厚说在fish里重复出来，不知真假。
【在 C****5 的大作中提到】
: 我试了2次，没做出来。293里面G10.
: 第一次是共转质粒和G10，48小时收样品。
: 第二次是先共转质粒和G10，然后24小时在转了一次个G10.
【在 C****5 的大作中提到】
: 我试了2次，没做出来。293里面G10.
: 第一次是共转质粒和G10，48小时收样品。
: 第二次是先共转质粒和G10，然后24小时在转了一次个G10.
C*5
40 楼
不要据说呀，去问问！😀
z*q
41 楼
之前我们这边也有一个实验室号称重复出来了，但是后来测序结果证明是假阳性，需要
看到测序结果才能确信。
【在 Q**e 的大作中提到】
: 据隔壁某薄厚说在fish里重复出来，不知真假。
看到测序结果才能确信。
【在 Q**e 的大作中提到】
: 据隔壁某薄厚说在fish里重复出来，不知真假。
i*0
42 楼
国内好多学生瞎搞。有的时候效率特别的高，想想在国外时候，一个新实验摸条件，设
计control，三个月能做一个key figure，国内的娃子一个月搞定（我这边没有贬低国
内学术的意见，只是看到一些不该看到。细思极恐的东西。）
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
计control，三个月能做一个key figure，国内的娃子一个月搞定（我这边没有贬低国
内学术的意见，只是看到一些不该看到。细思极恐的东西。）
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我用了addgene上的质粒，他的G10，也没有做出来。要么是他条件写错了
: 如果国内有很多组重复出来，只能说明我手臭了
j*n
43 楼
天朝有些实验室 主要是明星实验室 是247轮转的 出结果快也很正常
【在 i*********0 的大作中提到】
: 国内好多学生瞎搞。有的时候效率特别的高，想想在国外时候，一个新实验摸条件，设
: 计control，三个月能做一个key figure，国内的娃子一个月搞定（我这边没有贬低国
: 内学术的意见，只是看到一些不该看到。细思极恐的东西。）
【在 i*********0 的大作中提到】
: 国内好多学生瞎搞。有的时候效率特别的高，想想在国外时候，一个新实验摸条件，设
: 计control，三个月能做一个key figure，国内的娃子一个月搞定（我这边没有贬低国
: 内学术的意见，只是看到一些不该看到。细思极恐的东西。）
j*i
44 楼
不会真的有造假吧
From Google Group
------
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this system.
Kyle
看来即使work 效率也不太高 不太可能同时这么多人手笨的吧
From Google Group
------
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this system.
Kyle
看来即使work 效率也不太高 不太可能同时这么多人手笨的吧
X*8
45 楼
偶也担心被假阳性误导。但愿不是。有很多没经验的人会被假阳性误导的，也不见得是
诚心作假。小宝芳我也怀疑经验不足被假阳性误导，尤其是荧光技术，很容易有假阳性
的。
【在 z*******q 的大作中提到】
: 之前我们这边也有一个实验室号称重复出来了，但是后来测序结果证明是假阳性，需要
: 看到测序结果才能确信。
诚心作假。小宝芳我也怀疑经验不足被假阳性误导，尤其是荧光技术，很容易有假阳性
的。
【在 z*******q 的大作中提到】
: 之前我们这边也有一个实验室号称重复出来了，但是后来测序结果证明是假阳性，需要
: 看到测序结果才能确信。
c*6
46 楼
如果是假阳性，那么怎么解释他们的测序结果
【在 X*******8 的大作中提到】
: 偶也担心被假阳性误导。但愿不是。有很多没经验的人会被假阳性误导的，也不见得是
: 诚心作假。小宝芳我也怀疑经验不足被假阳性误导，尤其是荧光技术，很容易有假阳性
: 的。
【在 X*******8 的大作中提到】
: 偶也担心被假阳性误导。但愿不是。有很多没经验的人会被假阳性误导的，也不见得是
: 诚心作假。小宝芳我也怀疑经验不足被假阳性误导，尤其是荧光技术，很容易有假阳性
: 的。
X*8
47 楼
俺其实不关心韩的事情。只是就事论事。提一种常见的可能性。我知道这儿一个大牛让
手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
【在 c********6 的大作中提到】
: 如果是假阳性，那么怎么解释他们的测序结果
手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
【在 c********6 的大作中提到】
: 如果是假阳性，那么怎么解释他们的测序结果
j*i
48 楼
希望没有造假 我还跟我好几个同事介绍了这个工作 要是假的 我也挺没面子的
X*8
49 楼
我从不轻易介绍所谓的划时代发现，除非得道广泛证实。
【在 j******i 的大作中提到】
: 希望没有造假 我还跟我好几个同事介绍了这个工作 要是假的 我也挺没面子的
【在 j******i 的大作中提到】
: 希望没有造假 我还跟我好几个同事介绍了这个工作 要是假的 我也挺没面子的
c*6
50 楼
我也感觉一开始估计是假阳性，很有可能是因为假阳性的结果，几个人合伙画了一个饼
，最后就发明数据填。
【在 X*******8 的大作中提到】
: 俺其实不关心韩的事情。只是就事论事。提一种常见的可能性。我知道这儿一个大牛让
: 手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
: 的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
: 了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
: 实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
，最后就发明数据填。
【在 X*******8 的大作中提到】
: 俺其实不关心韩的事情。只是就事论事。提一种常见的可能性。我知道这儿一个大牛让
: 手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
: 的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
: 了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
: 实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
j*g
51 楼
正解。小保方晴子也是一样，看到细胞凋亡的自发荧光，误以为是oct4GFP ，然后的数
据都是前瞻性造假的。
韩是不是这种情况不好说，但是现在只要有一个实验室公开说重复出来了，并且是测序
了，质疑就烟消云散；各位重复不出来的都可以去面壁反思自己实验技术怎么那么差。
这也不涉及保密之类。但是现在一个重复的都没有
太可疑了
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:我也感觉一开始估计是假阳性，很有可能是因为假阳性的结果，几个人合伙画了一个
饼，最后就发明数据填。
据都是前瞻性造假的。
韩是不是这种情况不好说，但是现在只要有一个实验室公开说重复出来了，并且是测序
了，质疑就烟消云散；各位重复不出来的都可以去面壁反思自己实验技术怎么那么差。
这也不涉及保密之类。但是现在一个重复的都没有
太可疑了
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:我也感觉一开始估计是假阳性，很有可能是因为假阳性的结果，几个人合伙画了一个
饼，最后就发明数据填。
S*e
52 楼
说的太对了，所谓的大牛拼的都是概念和假说，假说嘛，反正就是用来被推翻的。他们
其实不太在乎solid的程度。
真正的好结果，需要自己每次做都能做出来，做不出来也得有合理的解释。
别人做不出来的原因只有一个，详细步骤没有写清楚。
【在 X*******8 的大作中提到】
: 俺其实不关心韩的事情。只是就事论事。提一种常见的可能性。我知道这儿一个大牛让
: 手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
: 的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
: 了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
: 实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
其实不太在乎solid的程度。
真正的好结果，需要自己每次做都能做出来，做不出来也得有合理的解释。
别人做不出来的原因只有一个，详细步骤没有写清楚。
【在 X*******8 的大作中提到】
: 俺其实不关心韩的事情。只是就事论事。提一种常见的可能性。我知道这儿一个大牛让
: 手下做29次实验只看中其中三次合其意的结果放入文章，照样science/nature的。造假
: 的太多。有很多人一开始是不愿意的，但架不住一开始受假阳性误导，一步步走的很深
: 了，最后自己都想方设法找证据支持自己。一个发现被人质疑很正常。直到被更多人证
: 实，这种质疑才会停止。是真金就不拍火炼。
X*8
53 楼
我倒真的希望不真是这样的。国内科研被不做科研的人把持太厉害了。希望籍此有个根
本性的改变。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 说的太对了，所谓的大牛拼的都是概念和假说，假说嘛，反正就是用来被推翻的。他们
: 其实不太在乎solid的程度。
: 真正的好结果，需要自己每次做都能做出来，做不出来也得有合理的解释。
: 别人做不出来的原因只有一个，详细步骤没有写清楚。
本性的改变。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 说的太对了，所谓的大牛拼的都是概念和假说，假说嘛，反正就是用来被推翻的。他们
: 其实不太在乎solid的程度。
: 真正的好结果，需要自己每次做都能做出来，做不出来也得有合理的解释。
: 别人做不出来的原因只有一个，详细步骤没有写清楚。
w*r
54 楼
不过是留了一手。造假不太可能。
S*e
55 楼
怎么可能根本性改变?
三流学校像韩这种导师的比例能有多少？
【在 X*******8 的大作中提到】
: 我倒真的希望不真是这样的。国内科研被不做科研的人把持太厉害了。希望籍此有个根
: 本性的改变。
三流学校像韩这种导师的比例能有多少？
【在 X*******8 的大作中提到】
: 我倒真的希望不真是这样的。国内科研被不做科研的人把持太厉害了。希望籍此有个根
: 本性的改变。
X*8
56 楼
当然不一定都是要倾向所谓的三流学校，至少大的项目不要完全被北上几个学霸把握。
我知道有很多除北清外地的学校做科研做的很好，就是很难拿到大项目。施颜这些做结
构的真不是生物的主要方向，却圈走了大部分的经费。清华那个忽悠生物芯片的居然搞
到好几个亿，最终也没做出什么来。从这点来说我还是希望韩没有被假象愚弄。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 怎么可能根本性改变?
: 三流学校像韩这种导师的比例能有多少？
我知道有很多除北清外地的学校做科研做的很好，就是很难拿到大项目。施颜这些做结
构的真不是生物的主要方向，却圈走了大部分的经费。清华那个忽悠生物芯片的居然搞
到好几个亿，最终也没做出什么来。从这点来说我还是希望韩没有被假象愚弄。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 怎么可能根本性改变?
: 三流学校像韩这种导师的比例能有多少？
r*t
57 楼
成精那里还不错吧，有一定的忽悠力度
我一个哥们去了，好像混成了个小头目，天天在微信上为博奥摇旗呐喊
【在 X*******8 的大作中提到】
: 当然不一定都是要倾向所谓的三流学校，至少大的项目不要完全被北上几个学霸把握。
: 我知道有很多除北清外地的学校做科研做的很好，就是很难拿到大项目。施颜这些做结
: 构的真不是生物的主要方向，却圈走了大部分的经费。清华那个忽悠生物芯片的居然搞
: 到好几个亿，最终也没做出什么来。从这点来说我还是希望韩没有被假象愚弄。
我一个哥们去了，好像混成了个小头目，天天在微信上为博奥摇旗呐喊
【在 X*******8 的大作中提到】
: 当然不一定都是要倾向所谓的三流学校，至少大的项目不要完全被北上几个学霸把握。
: 我知道有很多除北清外地的学校做科研做的很好，就是很难拿到大项目。施颜这些做结
: 构的真不是生物的主要方向，却圈走了大部分的经费。清华那个忽悠生物芯片的居然搞
: 到好几个亿，最终也没做出什么来。从这点来说我还是希望韩没有被假象愚弄。
c*6
58 楼
感觉国内好多都是忽悠，主要是忽悠管理基金的那帮外行，同行人一看就知道是啥玩意儿
【在 r*****t 的大作中提到】
: 成精那里还不错吧，有一定的忽悠力度
: 我一个哥们去了，好像混成了个小头目，天天在微信上为博奥摇旗呐喊
【在 r*****t 的大作中提到】
: 成精那里还不错吧，有一定的忽悠力度
: 我一个哥们去了，好像混成了个小头目，天天在微信上为博奥摇旗呐喊
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