C*n
2 楼
最近要将一个 3k+1k+2k的片段分别克隆到一个3k和8k 的载体上。试了两周Infusion
clone (Clontech, TAKARA）没弄出来。 Trouble-shooting过， 也用过overlap PCR
先assemble两个片段。但是仍然得到的是阴性结果（基于Colony-PCR和Restriction
enzyme digestion）。
之前一直用Infusion clone，虽然效率有高有低，但是这次彻底挂了。
理论上说Infusion比Gibson要效率高。当然其他方法如Golden Gate cloning， 还有
yeast recombination也许能行。不过似乎都有点麻烦。
请问各位大虾，对于我的这种情况，有没有其他类似高效快速的方法，或者克隆效率低
的可能性是什么呢？
不甚感谢。
clone (Clontech, TAKARA）没弄出来。 Trouble-shooting过， 也用过overlap PCR
先assemble两个片段。但是仍然得到的是阴性结果（基于Colony-PCR和Restriction
enzyme digestion）。
之前一直用Infusion clone，虽然效率有高有低，但是这次彻底挂了。
理论上说Infusion比Gibson要效率高。当然其他方法如Golden Gate cloning， 还有
yeast recombination也许能行。不过似乎都有点麻烦。
请问各位大虾，对于我的这种情况，有没有其他类似高效快速的方法，或者克隆效率低
的可能性是什么呢？
不甚感谢。
C*g
3 楼
其实就是因为多看了一个t字，后面是联想的，没动脑子。
i*a
4 楼
你这种片段应该gibson assembly很容易的，GA的话摩尔比很重要，我记得4个片段可以
能要vector:insert 1：3吧，而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗？可以
用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。
能要vector:insert 1：3吧，而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗？可以
用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。
M*n
5 楼
我看过的就不m了，哈哈哈
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
C*n
6 楼
谢谢回复。
没用过GA，感觉其实原理都类似。用Clontech 的Infusion，因为实验室刚好有这个kit
，然后Infusion的宣传页刚好有一个section，比较和GA的效率高低。那个brochure上
的数据显示Infusion比GA阳性率高得多...
引物设计是用Infusion的web-tool的。每条片段有20bp的overlap。PCR setup中的
Insert和plasmid ratio 也是根据web-tool建议的（2:1）。web-tool最后也给一个载
体图(.gb格式，和snap gene类似吧）。理论上说是不会设计错误的。
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你这种片段应该gibson assembly很容易的，GA的话摩尔比很重要，我记得4个片段可以
: 能要vector:insert 1：3吧，而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗？可以
: 用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。
没用过GA，感觉其实原理都类似。用Clontech 的Infusion，因为实验室刚好有这个kit
，然后Infusion的宣传页刚好有一个section，比较和GA的效率高低。那个brochure上
的数据显示Infusion比GA阳性率高得多...
引物设计是用Infusion的web-tool的。每条片段有20bp的overlap。PCR setup中的
Insert和plasmid ratio 也是根据web-tool建议的（2:1）。web-tool最后也给一个载
体图(.gb格式，和snap gene类似吧）。理论上说是不会设计错误的。
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你这种片段应该gibson assembly很容易的，GA的话摩尔比很重要，我记得4个片段可以
: 能要vector:insert 1：3吧，而且时间要1个小时比较好。你用snap gene软件吗？可以
: 用你设计的引物先做in silico assembly看有没有错。
o*1
7 楼
明明是塞芬。。
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
d*m
8 楼
几年没做过克隆了，技术贴帮顶。
c*7
9 楼
从此以后，请只在joke看笑话吧。。。
【在 M******n 的大作中提到】
: 我看过的就不m了，哈哈哈
【在 M******n 的大作中提到】
: 我看过的就不m了，哈哈哈
d*i
10 楼
我很多年以前国内时候做过类似的，那时候没见过高级的做法，就是把每个片段和载体
的末端设计好，然后每个片段和载体分别纯化好（载体切开后跑电泳时间长些确保切开
和分开了），做常规连接，多做好几管反应，分别转化涂板子。一般来说长出来的克隆
会很少，甚至非常少，少到一两个，但是由于片段之间的末端位点都不一样，一旦长出
来99%几率是阳性的。
的末端设计好，然后每个片段和载体分别纯化好（载体切开后跑电泳时间长些确保切开
和分开了），做常规连接，多做好几管反应，分别转化涂板子。一般来说长出来的克隆
会很少，甚至非常少，少到一两个，但是由于片段之间的末端位点都不一样，一旦长出
来99%几率是阳性的。
r*e
11 楼
哈哈,这个水平...
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
N*e
12 楼
我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后在用infusion到3kb载体
中。
载体的PCR尽量用极少的template，以防质粒污染PCR纯化结果。或者PCR完成后直接用
DpnI处理半小时。
如果你始终无法克隆，那说明目标质粒在Ecoli中不稳定，这种情况我见过，你就另想
办法了。
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后在用infusion到3kb载体
中。
载体的PCR尽量用极少的template，以防质粒污染PCR纯化结果。或者PCR完成后直接用
DpnI处理半小时。
如果你始终无法克隆，那说明目标质粒在Ecoli中不稳定，这种情况我见过，你就另想
办法了。
k*i
13 楼
“你是鸡丁？不，我是细肉丝。”的作者还没失业，还是交出徒弟来了。
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
【在 c*******7 的大作中提到】
: =。=
s*k
14 楼
我也用in-fusion好多年了 载体切彻底了 确实基本只需要挑一个克隆测序
连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
insertion
1
【在 N***e 的大作中提到】
: 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
: nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
: ：1：0.5。
连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
insertion
1
【在 N***e 的大作中提到】
: 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
: nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
: ：1：0.5。
d*f
15 楼
我来，哈哈哈
【在 M******n 的大作中提到】
: 我看过的就不m了，哈哈哈
【在 M******n 的大作中提到】
: 我看过的就不m了，哈哈哈
C*n
16 楼
谢谢分享您的经验。
我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页，用起来也很方便。
overlap区域的话是20bp，也是自动设计的。理论上说长一些的话，效率会更高一些。
这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
Qiagen的，后来嫌yield太低，换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样，但是应该不
会问题太大。
打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下，然后也order了一个 NEB
的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话，只能换其他方法了。
insertion
1
【在 N***e 的大作中提到】
: 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
: nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
: ：1：0.5。
我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页，用起来也很方便。
overlap区域的话是20bp，也是自动设计的。理论上说长一些的话，效率会更高一些。
这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
Qiagen的，后来嫌yield太低，换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样，但是应该不
会问题太大。
打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下，然后也order了一个 NEB
的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话，只能换其他方法了。
insertion
1
【在 N***e 的大作中提到】
: 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
: 成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
: In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
: 用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
: 和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
: 该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
: 是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
: ，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
: nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
: ：1：0.5。
w*d
17 楼
无语
C*n
18 楼
您是两个片段连接？（1 insert + linearized plasmid）。多片段的话，效率应当不
会这么高。
【在 s*****k 的大作中提到】
: 我也用in-fusion好多年了 载体切彻底了 确实基本只需要挑一个克隆测序
: 连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
:
: insertion
: 1
会这么高。
【在 s*****k 的大作中提到】
: 我也用in-fusion好多年了 载体切彻底了 确实基本只需要挑一个克隆测序
: 连接时片段载体用得极少 以至于好多年纯化后不测浓度了
:
: insertion
: 1
i*a
19 楼
祝好运吧！
N*e
20 楼
那个网页做得很差，你还不如自己手动检查一下你的linker region是否正确。三个
linker region必须不同，否则会全部自连。
我记得In-fusion说明书上说过15bp时效率最高。你说的越长越好应该是指Gibson
cloning。
NEB
【在 C****n 的大作中提到】
: 谢谢分享您的经验。
: 我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页，用起来也很方便。
: overlap区域的话是20bp，也是自动设计的。理论上说长一些的话，效率会更高一些。
: 这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
: Qiagen的，后来嫌yield太低，换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样，但是应该不
: 会问题太大。
: 打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下，然后也order了一个 NEB
: 的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话，只能换其他方法了。
:
: insertion
linker region必须不同，否则会全部自连。
我记得In-fusion说明书上说过15bp时效率最高。你说的越长越好应该是指Gibson
cloning。
NEB
【在 C****n 的大作中提到】
: 谢谢分享您的经验。
: 我一直也是这么做的。Clontech 有设计网页，用起来也很方便。
: overlap区域的话是20bp，也是自动设计的。理论上说长一些的话，效率会更高一些。
: 这个问题是刚换了实验室出现的。一个不同点是gel purification kit 。之前用的是
: Qiagen的，后来嫌yield太低，换成Zymo的了。还有就是Nanodrop 不一样，但是应该不
: 会问题太大。
: 打算用Infusion Plus 自带的gel purification kit 试一下，然后也order了一个 NEB
: 的NEBuilder HiFi DNA Assembly。仍然不work的话，只能换其他方法了。
:
: insertion
z*h
21 楼
Try Simple Cloning.
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