viruses|DNAJA3与PEDV S1蛋白相互作用影响病毒对宿主细胞的吸附

2023-01-02 17:01

研究背景：猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起严重的肠道疾病，给养猪业造成巨大的经济损失。有研究表明DNAJA3是Hsp40家族蛋白的成员，已知在多种病毒的复制中发挥重要作用。S蛋白负责病毒进入靶细胞，并在组织和细胞向性中起决定性作用。S基因的变异通常和毒力的显着变化有关，并且是病毒跨物种传播的潜在危险因素。S蛋白的胞外域包括 S1 和 S2 亚基，它们分别负责特异性受体结合和细胞膜融合。已经证明PEDV S1与假定的多肽受体相互作用，并且还在诱导细胞凋亡中发挥作用。

作为热休克蛋白 70 (Hsp70) 的协同伴侣和调节因子，DNAJA3 可通过刺激 HSP70 的 ATP 酶活性来调节蛋白质合成、折叠和膜转位，并参与 NF-KB 信号传导。

首先，作者分析 PEDV S1 与宿主蛋白之间的相互作用，使用PEDV S1作为靶点，筛选了猪肠样cDNA酵母文库。共有15种蛋白质被鉴定为 S1 的结合蛋白。其中，DNAJA3因其在早期研究中的抗病毒复制功能而被选择用于进一步研究，并且通过酵母杂交与双向 Co-IP 测定显示了 S1 和 DNAJA3 之间的相互作用。并且在在 IPEC-J2 细胞的细胞质中，DNAJA3 与 S1 明显共定位。DNAJA3 与病毒 dsRNA共定位在 PEDV 感染的 IPEC-J2 细胞中也很明显。为了进一步确认二者的相互作用，纯化的 DNAJA3-GST 和 PEDV S1 蛋白用于 GST pull-down 测定。结果证实了 DNAJA3 和 PEDV S1 在体外以及在表达这两种蛋白或感染 PEDV 的细胞中的相互作用。

为了确定与 DNAJA3 特定相互作用的 S1 区域，作者构建了一系列 S1 截短体。Co-IP 测定显示 S1 片段 1–479 (T3) 和 1–649 (T4) 能够与 DNAJA3 相互作用，但来自 1–279 (T1) 或 1–379 的片段(T2)，这表明与 DNAJA3 相互作用需要来自 S1 后半部分 aa379 和 aa479 之间的中间片段。

为了验证了 PEDV 和 DNAJA3 之间的关系，IPEC-J2 细胞以不同的PEDV剂量感染，并且在不同时间点检测 DNAJA3 表达的变化。结果表明，PEDV 感染细胞中的 DNAJA3 表达在 mRNA 和蛋白质水平上呈剂量依赖性降低，当将PEDV的量增加到1.5 MOI，它们显示出显着降低。在蛋白质水平上，DNAJA3 表达减少仅在36 hpi 时明显。这些结果表明对 DNAJA3 表达与病毒载量呈现负相关。

之前的研究表明，DNAJA3参与抑制多种病毒的复制。作者用pCMV-DNAJA3-Flag 转染的 IPEC-J2 细胞后进一步用 1.0 MOI 的 PEDV 感染。结果表明，DNAJA3 过表达细胞中的PEDV病毒RNA拷贝明显低于转染对照载体的细胞，培养上清液子代病毒滴度和病毒N蛋白的表达显着降低。

作者又在细胞上敲低DNAJA3的表达。靶向 DNAJA3 不同位点的 3 种 siRNA 的敲低都是有效的。选择 DNAJA3-3 （效果最优）用于后续实验。结果表明，DNAJA3 敲低促进了 PEDV 在 IPEC-J2 细胞中的复制，综上表明 DNAJA3 负向调节 PEDV 增殖。

PEDV 的周期包括吸附、内吞、复制和子代病毒体释放，作者在敲低或者过表达DNAJA3的细胞接种5 MOI的PEDV病毒，发现，在过表达的细胞中，降低了附着在细胞上的PEDV病毒的 mRNA，而内化的PEDV病毒的 mRNA的含量并没有变化。而敲低DNAJA3的细胞，附着在细胞上的PEDV病毒的 mRNA明显增加。这些结果表明 DNAJA3 抑制 PEDV 吸附，但不抑制 IPEC-J2 细胞的内化。

最后，鉴于病毒吸附发生在宿主细胞膜上，作者通过激光共聚焦成像表明 DNAJA3 位于用染料 DiI 染色的细胞膜上。并探讨了外源 DNAJA3 蛋白对病毒吸附的影响。与用GST处理的对照细胞相比，在与PEDV预孵育期间随着使用的DNAJA3数量增加，病毒RNA和N蛋白量显着降低，表明外源DNAJA3干扰PEDV吸附，从而减少它随后在细胞中的复制水平。

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9696540/pdf/viruses-14-02413.pdf

来源：ZhaoSunLab

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