Treg的功能鉴定：检测Responder T细胞的活化

Hi，大家好，我是小Q

本期，我们继续聊一聊，在Treg和Responder T共培养体系中，如何评价Treg细胞的功能。

定居在肿瘤微环境中的Treg细胞已经完全被肿瘤细胞绑架，成为了机体免疫力的“叛徒”。往期推文《Treg—被肿瘤绑架的叛徒》中提到了Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制，包括：

(1) 放冷箭：分泌IL-10等免疫抑制性因子。

(2) 夺资源：抑制T细胞的增殖。

(3) 离间盟友：抑制T细胞的活化。

大家知道，抗原提呈细胞APC是T细胞的“亲密盟友”。T细胞的活化需要跟APC进行2次“手拉手”：第一次是T细胞的TCR与APC细胞的MHC II分子结合，第二次是T细胞的CD28与APC细胞的CD80/86结合。

Treg细胞高表达CTLA-4分子，该分子与CD80/CD86的亲和性强于CD28，会抢先跟APC“手拉手”。就这样，T细胞失去了跟APC第二次“手拉手”的机会，失去了APC这个盟友，T细胞的活化受阻。

 图 1 Treg发挥免疫抑制功能的机制 ^[1]

参照上期推文《Treg的功能鉴定：构建Treg和Responder T共培养体系》，制备Treg细胞和Responder T细胞，Naïve CD4⁺ T细胞标记CFSE染料，按照Treg : Responder T=0:1，1:1，1:2，1:4，1:8的比例^[2]，Treg细胞和Responder T细胞共培养3天。

共培养结束时，测定Responder T细胞的增殖和活化：

(1) 采用流式细胞术，测定Responder T细胞中细胞质荧光探针CFSE的表达情况; 

(2) 采用流式细胞术，检测Responder T细胞分泌细胞因子IFNγ的能力；

(3) 通过酶联免疫吸附实验 (ELISA)鉴定Responder T细胞IFNγ的分泌量。

图 2 Treg细胞和Responder T细胞共培养体系示意图

3.1 流式细胞术检测Responder T细胞合成IFNγ的能力^[3]

原理：

II型干扰素IFNγ（Interferon γ）主要由自然杀伤细胞 (NK)、自然杀伤T细胞 (NKT) 、Th1型CD4⁺ T细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞分泌。

IFNγ与其受体IFNγ R（由2个α亚基和1个β亚基构成）结合之后，激活JAK1/2-STAT1-IRF-1-GAS信号通路，能够诱导肿瘤细胞凋亡和休眠，激活巨噬细胞（如诱导MHC II的表达），从而发挥抗肿瘤效应。

IFNγ也能够诱导肿瘤细胞表达PD-L1，从而抑制免疫应答，发挥促肿瘤效应。因此，IFNγ是一种多效性的细胞因子。

活化的CD4⁺ T细胞具有分泌IFNγ的能力。但这些活化的CD4⁺ T细胞平日里喜欢安安静静地躺平，只有接收到信号时才会分泌IFNγ，这个信号由DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2⁺)同时发送。

DAG和Calcium共同作用，激活Protein kinase C(PKC)，进而引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致IFNγ等多种蛋白的产生。

产生的IFNγ经由内质网转运至高尔基体，再转运出细胞外，IFNγ从高尔基体向细胞外地转出，需要细胞内外的跨膜离子梯度。

在体外试验中，我们可以：

(1) 采用商品化的刺激剂，唤醒躺平的CD4⁺ T细胞，让它们产生IFNγ；

(2) 加入阻断剂，使IFNγ不被转运出细胞而在细胞质中蓄积，

(3) 在细胞膜上打孔，让荧光抗体钻进细胞质，跟IFNγ结合；

(4)通过流式细胞仪检测IFNγ的含量，评估CD4⁺ T细胞分泌IFNγ的能力，作为CD4⁺ T细胞活化的依据。

目前，比较常用的刺激剂有两种：1. PMA (佛波酯)；2.lonomycin (离子霉素)，PMA是DAG的模拟物，lonomycin 是Ca2⁺的转运剂，可将细胞器内的Ca2⁺ 转运到细胞质。

常用的阻断剂有两种：1. Brefeldin A (BFA，布雷非德菌素a)；2. Monensin (莫能霉素)。BFA是一种真菌代谢物，可以干扰IFNγ自粗面内质网至高尔基体的转运。Monensin是一种离子载体，可选择性结合单价阳离子并把这些阳离子转运到细胞膜内，破坏跨膜离子梯度，阻断IFNγ从高尔基体转运到胞外。

大家可以去购买刺激剂和阻断剂的混合物，如Invitrogen^™的细胞刺激混合物（加蛋白转运抑制剂）、BD Biosciences的Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug^TM，按照推荐浓度加入共培养体系中，刺激阻断4~6小时，就可以检测到细胞质中的IFNγ了。

常规试剂：PBS缓冲液；去离子水；4%多聚甲醛。

特殊试剂：

耗材：流式管。

仪器：离心机；流式细胞仪。

实验步骤：

(1) 刺激IFNγ产生并阻断其分泌到胞外：用PBS缓冲液将eBioscience^™ 细胞刺激混合物（加蛋白转运抑制剂）(500×)稀释50倍，按照体积比1:10，加入Treg和Responder T共培养体系中，37℃，5% CO2，刺激4~6小时。设置未加刺激&阻断剂的阴性对照。

(2) 收集细胞：各孔细胞收集在不同的流式管中，500g离心6min，收集细胞上清，-80℃保存，用于ELISA检测细胞因子IFNγ。细胞沉淀用1ml PBS清洗1遍，400g离心5分钟，弃去上清，加入0.2ml PBS重悬细胞。

(3) 配置死细胞染料：Fixable Viability Stain 520呈粉末状，用130μl DMSO溶解，震荡混匀，制成死细胞染料储液，-20℃避光保存。

(4) 标记死细胞：在0.2ml细胞悬液中加入0.2μl 死细胞染料储液，吹打混匀，室温避光孵育10-15min，500g离心6分钟，弃去上清。在细胞沉淀中加入1ml MACS® Separation Buffer重悬细胞，500g离心6分钟，弃去上清。

(5) 细胞膜固定打孔；弃去上清之后，流式管中一般会残留50µl MACS® Separation Buffer，再补加50µl MACS® Separation Buffer，充分吹打重悬细胞，每个流式管加入100μl IC Fixation Buffer (品牌：Invitrogen^™; 货号：00-8222)，吹打混匀，4℃避光固定30分钟。

(6) 制备1×细胞破膜工作液： 将1份10×浓缩液（Permeabilization Buffer 10X 品牌：Invitrogen^™；货号: 00-8333）与9份蒸馏水混合。

(7) 细胞质IFNγ染色：细胞固定完成之后，每管添加1ml的1×细胞破膜工作液，600g离心6分钟，弃去上清。采用1×细胞破膜工作液配制IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)，即1ml的1×细胞破膜工作液中加入6.25µl的IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)，100µl/管加入到细胞沉淀中，吹打混匀，避光孵育30分钟。

设置Isotype对照，即取一管加过刺激&阻断剂的细胞，不加IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)，而加入Rat lgG1 kappa Isotype Control(eBRG1),APC。

(8) 洗去多余的IFNγ抗体：染色完成后，每管补加1ml的1×细胞破膜工作液，600g离心8分钟，弃去上清。

(9)  流式细胞术检测IFNγ：去除细胞碎片，去除细胞粘连体，去除Fixable Viability Stain 520（BV510/V500通道）阳性的死细胞，圈出CFSE（FITC通道）阳性细胞，即Responder T细胞，采用散点图展示IFNγ染色情况。

由于Naïve CD4⁺ T与Treg共培养的数据尚未发表，我们以CD8⁺ T细胞内IFNγ的检测给大家示例:

 图 4 流式检测T细胞产生IFNγ 的能力

3.2 ELISA检测Responder T细胞IFNγ的分泌量^[4]

原理：

流式细胞术测定的IFNγ，是活化的T细胞收到刺激阻断信号，在4~6小时合成的IFNγ，表征T细胞产生IFNγ的能力。

在Responder T细胞与Treg共培养的3天时间里，Responder T细胞接受CD3和CD28传递的信号，活化，产生IFNγ并分泌到细胞培养上清液中，因此，我们可以通过酶联免疫吸附检测技术检测上清液中IFNγ的含量，用以评估T细胞在活化过程中分泌的IFNγ的量。

试剂：Mouse Interferon Gamma (IFNg) ELISA Kit（品牌：Reddot Biotech，货号：RD-IFNg-Mu），检测范围15.625-1000pg/mL，敏感性5.3pg/mL；去离子水。

耗材： 50ml离心管，移液枪，25ml容积的干净容器。

仪器：酶标仪。

操作步骤：

ELISA的操作步骤，小伙伴们可以参照往期推文《Treg的功能鉴定：ELISA测定IL-10分泌量》。

需要注意：在测定所有样本之前，先取1~2个样本进行预实验。T细胞活化过程中IFNγ的分泌量较高，需要稀释几十甚至几百倍才能在ELISA试剂盒的检测范围内。未做预实验直接一锅端，可能会劳财劳神颗粒无收，大家一定要当心哦。

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