Treg的功能鉴定：构建Treg和Responder T共培养体系

图 1 Treg发挥免疫抑制功能的机制 ^[1]

定居在肿瘤微环境中的Treg细胞已经完全被肿瘤细胞绑架，成为了机体免疫力的“叛徒”。

往期推文《Treg—被肿瘤绑架的叛徒》中提到了Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制，包括：

(1) 放冷箭：分泌IL-10等免疫抑制性因子。Treg细胞通过释放免疫抑制性细胞因子（IL-10、TGF-β和IL-35）和杀伤分子（穿孔素与颗粒酶B），既能抑制效应性T细胞活化增殖，同时诱导效应性T细胞凋亡。

(2) 夺资源：抑制T细胞的增殖。T细胞的存活和增殖需要细胞因子IL-2，IL-2与IL-2受体结合，向T细胞内传递信号，触发T细胞的增殖行为。缺乏IL-2会导致T细胞的增殖受到抑制而发生凋亡。

经典的CD8⁺ T和CD4⁺ T细胞（Responder T）表达IL-2受体，同时也能产生细胞因子IL-2，呈现出自给自足的和谐画面。

而Treg是个“奇葩”，它们表达IL-2受体，却不产生IL-2因子，并且相比于Responder T，Treg细胞上IL-2受体的表达量更高，对IL-2的亲和力更强，因此Treg喜欢竞争性掠夺Responder T的IL-2因子。

当Responder T与Treg共培养时，T细胞产生的IL-2因子大部分被Treg消耗，无力维持自身增殖需要。

(3) 离间盟友：抑制T细胞的活化。大家知道，抗原提呈细胞APC是T细胞的“亲密盟友”。T细胞的活化需要跟APC进行2次“手拉手”：第一次是T细胞的TCR与APC细胞的MHC II分子结合，第二次是T细胞的CD28与APC细胞的CD80/86结合。

Treg细胞高表达CTLA-4分子，该分子与CD80/CD86的亲和性强于CD28，会抢先跟APC“手拉手”。

就这样，T细胞失去了跟APC第二次“手拉手”的机会，失去了APC这个盟友，T细胞的活化受阻。

鉴定Treg细胞的功能，通常需要构建Treg细胞和Responder T细胞共培养体系。Treg细胞可以通过磁珠分选、流式分选或体外诱导的方案获得。

Responder T细胞可以选用CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、Pan-T细胞（包括CD8⁺ T和CD4⁺ T细胞）或CD4⁺ CD25^- T细胞，这些Responder T细胞都可以通过磁珠分选或流式分选的方法获取。

今天我们以体外诱导的iTreg细胞和Naïve CD4⁺ T细胞为例，给大家介绍Treg细胞和Responder T细胞的共培养体系的构建方案。

常规试剂：PBS缓冲液；RPMI 1640培养基；胎牛血清；β-巯基乙醇；青霉素-链霉素双抗（100×）。

特殊试剂：

耗材：96/48/24孔平底细胞培养板；6cm培养皿，泡沫板（充当简易版手术台），无菌镊子，无菌手术剪刀，50ml无菌离心管，70µm孔径细胞筛网（BD Biosciences，货号：352350），5ml注射器，流式管；5ml无菌离心管（STEMCELL, 货号：38007）。

仪器：超净工作台；4℃冰箱；离心机；涡旋震荡仪；计时器；EasySep™ Magnet (STEMCELL, 货号：18000)；细胞计数仪；CO₂细胞培养箱。

动物：6-8周龄雌性C57BL/6小鼠

操作步骤（在超净工作台中操作）：

图 2 iTreg与Naive CD4⁺ T共培养示意图 ^[2]

(1)配置淋巴细胞培养液LCM（Lymphocyte culture medium）：500ml RPMI 1640培养基中加入50ml 胎牛血清，50μM β-巯基乙醇，5ml青霉素-链霉素双抗（100×）。 

(2)CD3预包被：在2.5ml PBS缓冲液中加入LEAF^TM Purified anti-mouse CD3 10μl，终浓度4μg/ml，200µl/孔，加入到96孔平底细胞培养板中。4℃冰箱包被过夜，使CD3结合在平底细胞培养板的板底。

(3)诱导iTreg细胞：参考往期推文《Treg细胞的体外诱导分化》^[2]。

(4)获取Naïve CD4⁺ T细胞：参考往期推文《Treg细胞的体外诱导分化》^[3]。

(5)配置细胞追踪染料CFSE：向1管CellTrace CFSE粉末中加入18µl DMSO溶解粉末，配置成5µM的细胞追踪染料。

(6)Naïve CD4⁺ T细胞CFSE染色：3ml PBS中加入3µl CFSE染料溶解配成CFSE溶液（0.5µM）。取3×10⁶ Naïve CD4⁺ T细胞，400g离心6min，弃去上清，用CFSE溶液（0.5µM）重悬，37℃避光孵育20分钟。

(7)洗去多余的CFSE染料：在CFSE溶液重悬的Naïve CD4⁺ T细胞中加入12ml淋巴细胞培养液LCM ，室温孵育5分钟，400g离心6min，弃去上清，用5ml 淋巴细胞培养液LCM重悬细胞，400g离心6min，弃去上清。用1.5ml 淋巴细胞培养液LCM重悬细胞，计数，将细胞浓度调整为1×10⁶/ml（染色过程中最多损失1/2细胞）。

(8)Naïve CD4⁺ T细胞添加CD28：Naïve CD4⁺ T细胞悬液中，加入LEAF^TM Purified anti-mouse CD28，浓度为2μg/ml。

(9)Responder T细胞种板：吸弃96孔板中的CD3预包被液，加入Naïve CD4⁺ T细胞（CFSE染色，添加CD28），100µl/孔（1×10⁵/孔）。

(10)Treg细胞种板：将iTreg细胞浓度调整为1×10⁶/ml，根据Treg : Responder T=0:1，1:1，1:2，1:4，1:8的比例，依次加0µl ，100µl，50µl，25µl，12.5µl的iTreg细胞溶液与Responder T细胞共培养。

(11)Treg和Responder T共培养：37℃，5% CO2培养3天。

详细的操作介绍完了，大家了解Treg和Responder T共培养体系的构建思路了吗？小Q想要提醒大家，以上操作只是一个例子，大家可以根据自己的需求进行DIY，例如，3种Treg和4种Responder T，可以DIY出12种不同的共培养体系。

Treg：① 磁珠分选、② 流式分选、③ 体外诱导。

Responder T：① CD8⁺ T、② CD4⁺ T、③ Pan-T、④ CD4⁺ CD25^- T。

大家在构建共培养体系时，有个细节要注意：Treg和Responder T的细胞比例，不一定全都按照0:1，1:1，1:2，1:4，1:8进行，可以根据预实验结果选择合适的共培养比例，但0:1组一定要保留。

那么怎样的比例，才是合适的共培养比例呢？请大家持续关注君莲数据库，我们下回探讨~