Treg细胞表型鉴定：RT-PCR&流式检测Foxp3表达量

1.1 抽提mRNA ^[2]

 图 1 mRNA抽提流程

试剂：TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（Cat. # 9767）；PBS缓冲液；70%乙醇。

耗材：48孔平底细胞培养板。

仪器：离心机；NanoDrop™ One/OneC微量紫外-可见光分光光度计。

操作步骤：

(1)  收集细胞（推荐量1.0~3.0×10⁶ 细胞），用1ml PBS清洗2遍，400g离心5分钟。

(2)  裂解细胞：向细胞中加入350µl Buffer RL，轻轻吹打裂解细胞，至无肉眼可见的细胞沉淀（可以-80℃冻存）。

(3) 去除基因组DNA：将gDNA Eraser Spin Column放置在2 ml Collection Tube上，加入细胞裂解液，12000 rpm离心1 minutes，收集流出相。

(4) 析出mRNA：在流出相中加入等体积的70% 乙醇，上下吹打充分混匀，得组份1。

(5) mRNA挂柱：将RNA Spin Column放在2 ml Collection Tube上，转入组份1，12000 rpm离心1 minutes，弃掉流出相。

(6) 清洗mRNA：在RNA Spin Column中分次加入溶液（500μl RWA，600μl RWB，600μl RWB），每次加完溶液12000 rpm，离心30 seconds，弃流出相。

(7) 去除mRNA中残留的清洗液和乙醇：将RNA Spin Column放回2 ml Collection Tube，12,000 rpm离心2 minutes。将RNA Spin Column 放到新的1.5 ml RNase Free Collection Tube上，室温静置10min（使乙醇挥发完全）。

(8) 溶解并收集mRNA：在RNA Spin Column膜的中心位置加入50-200μl的RNase-free water，室温静置15min。12,000 rpm离心2 minutes，收集流出相。

(9) 测定mRNA浓度：采用NanoDrop™ One/OneC微量紫外-可见光分光光度计测定mRNA浓度，使其终浓度小于等于62.5ng/μl。

1.2 mRNA逆转录为cDNA^[3]

试剂：PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（Takara，货号：RR036A）；Rnase Free H₂O。

耗材：200µl PCR管。

仪器：PCR仪。

实验步骤：

（10）冰上配制RT反应液：

（11）进行逆转录反应：

1.3 嵌合荧光染色法定量PCR^[4]

试剂：SYBR® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)（Takara，货号：RR820B）；Rnase Free H₂O。引物序列如下表：

耗材：0.6ml或1.5ml Rnase Free 离心管，200µl PCR管或96孔RT-PCR反应板。

仪器：Applied Biosystems7500/7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)。

实验步骤：

(10) RT-PCR仪开机预热：仪器Applied Biosystems7500/7500 Fast Real-Time PCR System开机预热。

(11) 配置RT-PCR反应液：按照下列组分配制PCR反应液（冰上进行），考虑到吸取误差，配置的预混液体积至为所有反应用总体积的110%。

以20µl体系为例，PCR反应液的配置技巧如下：

① 配制ddH₂O+cDNA模板预混液；

② 配制正向引物+反向引物预混液；

③ 配制SYBR Premix+ROX Reference Dye II预混液；

④ 将SYBR Premix+ROX Reference Dye II预混液加入正向引物+反向引物预混液；

⑤ 点板：ddH₂O+cDNA模板预混液，8μl/孔，加入RT-PCR反应孔底部。正向引物+反向引物+SYBR Premix+ROX Reference Dye II预混液，12μl/孔，加入RT-PCR反应孔左侧面。

⑥ RT-PCR反应孔，1000g，4℃离心5min。

(12) 进行RT-PCR反应调整Applied Biosystems7500/7500 Fast Real-Time PCR System仪器参数，进行RT-PCR反应。

Stage 1：预变性

Number of Cycles：1

95℃  30秒

Stage 2：PCR反应

Number of Cycles：40

95℃  30秒

60℃  30秒

Melt Curve Stage

1.4 RT-PCR数据处理

Foxp3的基因表达量=2^{（内参GAPDH的Ct值-Foxp3的Ct值）}

试剂：

耗材：流式管。

仪器：离心机，流式细胞仪。

实验步骤（在超净工作台中操作）：

2.1 采用死细胞染料标记死细胞

(1)收集细胞：（推荐量1.0~3.0 × 10⁶ 细胞），用1ml PBS清洗2遍，400g离心5分钟，弃去上清，加入1ml PBS重悬细胞。

(2)溶解死细胞染料：Fixable Viability Stain 520呈粉末状，用130μl DMSO溶解，震荡混匀，制成活细胞染料储液，-20℃避光保存。

(3)标记死细胞：在1ml细胞悬液中加入1μl 活细胞染料储液，吹打混匀，室温避光孵育10-15min，400g离心5分钟，弃去上清。 

2.2 采用anti-CD4和anti-CD25抗体标记Treg细胞表面CD4和CD25分子

(4)清洗多余的死细胞染料：在细胞沉淀中加入1ml MACS® Separation Buffer重悬细胞，400g离心5分钟，弃去上清。

(5)标记表面抗体CD4和CD25：在细胞沉淀中加入100μl MACS® Separation Buffer重悬细胞，在细胞悬液中加入1μl Anti-CD4-FITC抗体和1.25μl Anti-CD25-FITC抗体，室温避光染色20分钟。

(6)清洗多余的表面抗体：加入1ml MACS® Separation Buffer清洗多余抗体，400g离心5分钟，弃去上清。

2.3 采用anti-Foxp3抗体标记Treg细胞核内转录因子Foxp3

(7)重悬细胞：添加80μl  MACS® Separation Buffer重悬细胞。

(8)配置细胞核固定/破膜液

Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution，即2 ml 的Fixation/Permeabilization Concentrate（4×）（货号：00-5123）和6ml Fixation/Permeabilization Diluent（货号：00-8333）混匀。

(9)细胞固定，核膜打孔：在细胞悬液中加入500μl 细胞核固定/破膜液，吹打混匀，4℃避光孵育45分钟。

(10)配置1×细胞核破膜液：Perm/Wash Buffer working solution，即1ml的Permeabilization Buffer（10×）（货号：00-8333）和9ml 的去离子水混匀。

(11)清洗细胞核固定/破膜液：（此步骤重复2次）：细胞悬液500g离心6分钟，弃去上清，加入1ml 1×细胞核破膜液，500g离心6分钟，弃去上清。

(12)Foxp3染色：在细胞沉淀中加入80μl 1×细胞核破膜液重悬细胞，在细胞悬液中加入5μl Anti-Foxp3-PE抗体，室温避光孵育35分钟。

(13)清洗多余的Foxp3抗体：（此步骤重复2次）：细胞悬液500g离心6分钟，弃去上清，加入1ml 1×细胞核破膜液，500g离心6分钟，弃去上清。

(14)流式检测：在细胞沉淀中加入300 µl MACS® Separation Buffer重悬细胞，流式细胞仪检测Treg细胞。

(15)分析Treg表型：采用Flowjo软件分析Treg细胞的表型，目前公认的Treg细胞表型可以采用CD4⁺ CD25⁺Foxp3⁺T，或CD4⁺ Foxp3⁺T，以往期推文《Treg细胞的体外诱导分化》方法中获得的iTreg为例，检测结果如下：

 图2  iTreg表型鉴定

详细的操作介绍完了，大家学会怎样鉴定Treg细胞的表型了吗？那就赶快行动起来吧！如果想要进一步了解Treg的功能鉴定方法，一定要持续关注君莲数据库哦~