JV | 宿主蛋白PSMD12通过介导甲型流感病毒M1蛋白泛素化调控病毒复制

2023-01-06 08:01

宿主蛋白PSMD12通过介导甲型流感病毒M1蛋白泛素化调控病毒复制

背景介绍

甲型流感病毒(IAV)每年造成全球约29万至65万人死亡，近年来，一种新的高致病性禽流感病毒H5N6已取代H5N1成为在水禽中传播并引起我国人类感染的主要IAV亚型之一，对人类健康造成很大威胁。

宿主蛋白和流感病毒之间的相互作用是调节病毒复制和致病性的重要机制。流感病毒的复制强烈依赖于宿主细胞；病毒通过“劫持”宿主细胞的生物学过程并利用其能量、脂质、RNA和蛋白质来完成自己的复制周期。M1基质蛋白是流感病毒中的一种252个残基的结构蛋白，是IAV最丰富和最保守的蛋白之一。M1在病毒萌发和组装过程中起关键作用。尽管M1在功能上很重要，但很少有研究探索哪些宿主蛋白参与调节流感病毒生命周期中M1的功能及其特定的分子机制。

鸟类，特别是水禽，在保存和传播流感病毒方面发挥着核心作用。因此，本研究的目的是研究鸡胚成纤维细胞DF1细胞中与H5N6病毒M1蛋白相互作用的蛋白，以确定与流感病毒生命周期有关的宿主蛋白，并确定其作用机制。这项研究发现了一种以前未知的宿主蛋白，在鸡DF1和人类A549细胞中复制流感病毒所需的蛋白，并发现M1上的一个高度保守的氨基酸位点用于抗病毒药物的开发。

方法和结果

首先，作者用质谱仪分析了与HA标记的流感病毒蛋白M1免疫共沉淀的宿主蛋白。然后为了找出影响病毒复制的宿主因素，成功将15个候选宿主基因克隆到pCAGGS载体中并导入DF1细胞，然后感染流感病毒，测定病毒滴度和细胞活力。感染后24小时，取培养上清液进行空斑分析。最后，成功验证了3个正调控基因和5个负调控基因。其中，PSMD12对病毒增殖的正向调控作用最强（图1）。

图1、PSMD12被鉴定为对H5N6流感病毒的增殖具有积极的调节作用

随后，为了进一步验证PSMD12对流感病毒的调控作用，作者在禽类DF1细胞中设计了三个针对PSMD12的SiRNAs，DF1细胞在siRNA转染后24h感染H5N6病毒。在不同时间点收集上清液进行TCID50的测定，并收集细胞进行Western印迹分析。结果显示，PSMD12敲除后在24小时和36小时后显著降低了病毒滴度，为了排除敲除PSMD12可能导致DF-1细胞毒性的可能性，作者还进行了细胞活力测试，结果表明PSMD12的敲除对细胞活力没有明显影响(图2A-D)。为了评价敲除PSMD12基因对禽流感病毒H5N6在人细胞中增殖的影响，作者用相同的方法在人A549细胞中进行了试验，得到了一致的结果（图2E-H）。这些结果表明，禽类和人的PSMD12蛋白对H5N6禽流感病毒都有积极的调节作用。

图2、PSMD12基因敲除可抑制H5N6病毒复制。

一般来说，26S蛋白酶体与细胞蛋白质的修饰密切相关，包括泛素化。

为了研究PSMD12(26S蛋白酶体调节亚基)是否调节M1的泛素化，作者将编码Flag-M1和HA-Ub的质粒与Myc标记的PSMD12一起导入HEK293T细胞。结果清楚地证明了M1可以泛素化(图3A)，而且PSMD12的过度表达增强了M1的泛素化(图3B)。此外为了探索泛素链在M1中的连接类型，作者将7种泛素载体与空载体或Flag-M1共转染进行泛素化检测，结果表明，与K6、K11、K29、K33、K48和K63共转染后，Flag-M1的泛素化信号明显增强，而与K27共转染后泛素化信号没有明显增强(图3C)。这一结果表明，M1可以被K6、K11、K29、K33、K48和K63泛素化。为了确定PSMD12介导的M1泛素化是否通过K6、K11、K29、K33、K48或K63发生，作者使用HA标记的K6、K11、K29、K33、K48和K63进行泛素化检测。结果表明，PSMD12的过表达明显增加了K63的连接(图3D-I)。

图3、宿主蛋白PSMD12触发K63连接的M1泛素化。

随后，作者利用生物信息学方法预测H5N6毒株M1可能的泛素化位点，基于选择8个赖氨酸残基(K21、K35、K98、K101、K102、K113、K187和K242)构建M1突变体(分别为K到R)（图4A）。然后将野生型和H5N6-M1突变体K~R、HA-K63和Myc-PSMD12分别导入HEK293T细胞。随后的泛素化实验结果表明，在M1的K102位突变后，PSMD12介导的K63连接的M1泛素化明显降低(图4B)。此外，为了验证M1-K102位点是否与M1-PSMD12相互作用相关，作者进行了共IP分析。结果表明，在8个M1突变体(K21R、K35R、K98R、K101R、K102R、K113R、K187R和K242R)中，K102突变最明显地削弱了M1与PSMD12之间的相互作用。将编码FlagM1/Flag-M1-K102R和HA-PSMD12的质粒共转染HeLa细胞后，进行免疫荧光实验。结果与上述一致（图4F）。综上所述，这些发现表明，K102不仅是PSMD12介导的K63连接的M1泛素化的重要位点，而且也参与了M1和PSMD12之间的相互作用。

图4、K102位点是K63连接的M1泛素化的关键，K102R削弱了M1和PSMD12之间的相互作用

为了研究M1-K102位点突变在流感病毒增殖中的影响，作者构建了K102位单一突变的突变病毒，命名为H5N6-M1-K102R，与感染H5N6-WT病毒相比，感染H5N6-M1-K102R病毒导致DF1细胞培养上清液中病毒产量显著降低。值得注意的是，虽然感染H5N6-M1-K102的细胞上清液中的病毒产量降低，但与感染WT病毒的细胞相比，细胞裂解物中的M1水平显著增加。这些结果表明，K102的M1突变可能阻止病毒释放到上清液中（图5A-D）。此外，作者评估了WT和M1突变病毒在对照和PSMD12过表达或敲除细胞中的复制。结果表明，PSMD12过表达促进了H5N6病毒的增殖，而PSMD12基因敲除可抑制H5N6对DF1细胞的增殖。然而，PSMD12的过表达和敲除都不能显著影响H5N6-M1-K102R在DF1细胞上的增殖（图5E-H）。综上所述，这些发现进一步证明PSMD12正向调控H5N6病毒增殖的机制与M1的K102位点有关。

图5、M1K102位点的突变对病毒在细胞中增殖的影响

接下来，作者对M1-K102位点突变和抑制PSMD12如何影响病毒进行了研究。首先研究了PSMD12及其修饰的M1-K102位点是否在病毒出芽实验之前影响M1-M2 VLP的释放。结果显示，PSMD12的过表达促进了上清液M1 VLP的释放，说明PSMD12促进了M1-M2 VLP的形成（图6A、B）。随后，作者在透射电镜下观察WT型H5N6-M1和突变型H5N6-M1-K102R感染细胞后释放的病毒粒子的形态。发现感染后，H5N6-M1-K102R病毒形成的颗粒仍然附着在质膜上，与感染WT病毒后完全释放的IAV颗粒相反，这表明病毒出现缺陷表型与M1的K102突变有关。此外，H5N6-M1-K102R的形态与H5N6-M1明显不同。具体而言，大多数突变病毒颗粒呈丝状，只有少数呈球形（图6C-F）。为了进一步了解M1K102位点或PSDM12对病毒粒子释放的影响，作者进行了单周期高MOI感染实验。将H5N6-M1或H5N6-M1-K102R病毒以MOI为5感染DF1细胞，在感染后收集不同时间点的细胞裂解物和上清液。定量检测细胞培养上清液和细胞裂解物中的病毒RNA。结果表明，在感染初期(感染后0h和感染后4h)，细胞裂解物中M1的RNA无显著差异，但在感染初期(感染后4h)，M1的RNA与感染前相比无显著差异。H5N6-M1-K102R在6 HPI和8 HPI上显著高于H5N6-M1。与此相符的是，两种病毒(H5N6-M1和H5N6-M1K102R)上清液中的RNA在8HPI时显著高于感染初期。重要的是，H5N6-M1-K102R的RNA显著低于H5N6-M1(图6G-H)。为了进一步了解宿主PSDM12对病毒粒子释放的影响，在DF1细胞中用siRNA敲除PSMD12，并用H5N6-M1感染。结果表明，PSMD12基因敲除后，细胞裂解产物中RNA含量增加，细胞培养上清液中RNA含量降低（图6J）。综上所述，这些结果表明PSMD12和M1K102对甲型流感病毒释放的调节具有相似的影响趋势。

图6、M1 K102突变或敲除PSMD12会限制病毒的释放

鉴于H5N6病毒M1基因K102位的单一突变限制了M1和病毒的释放，作者接下来研究了M1-K102R突变病毒在C57/BL6小鼠中的致病性。作者用WT和M1-K102R突变株H5N6病毒接种小鼠，结果表明，H5N6-M1-K102R病毒的致病性明显低于WT病毒，感染H5N6-M1病毒的小鼠表现出严重的体重减轻、疾病和60%的死亡率，而感染相同剂量的H5N6-M1-K102R病毒的小鼠表现出30%的死亡率（图7）。这些数据表明，M1基因K102位的突变削弱了JX(H5N6)流感病毒对小鼠的致病性和致死性。