Re: DNA Ligation problem# Biology - 生物学
r*o
1 楼
几个小建议：
(1) 去磷酸化不是那么重要。
(2)换新的连接酶尤其是新的BUFFER。连接反应的BUFFER
非常容易坏，因为里面有ATP，冻融几次就不行了。
(3)载体和插入片段的量要足够。建议插入片段的量越多
越好。我一般让片段的莫尔量是载体的几十倍。
(4)既然你用琼脂糖凝胶纯化你的片段。我估计你用UV照射过
胶来确定位置，然后切下有DNA的部分，是吧？UV照射下，
很容易让DNA形成嘧啶二聚体，急剧降低连接效率。所以你要么
不用gel purification，如果必须分离两个片段，你可以
同时在两条LANE上跑少量的DNA和大量的DNA，切下少量DNA的
胶用UV照射确定所要片段的位置。
(1) 去磷酸化不是那么重要。
(2)换新的连接酶尤其是新的BUFFER。连接反应的BUFFER
非常容易坏，因为里面有ATP，冻融几次就不行了。
(3)载体和插入片段的量要足够。建议插入片段的量越多
越好。我一般让片段的莫尔量是载体的几十倍。
(4)既然你用琼脂糖凝胶纯化你的片段。我估计你用UV照射过
胶来确定位置，然后切下有DNA的部分，是吧？UV照射下，
很容易让DNA形成嘧啶二聚体，急剧降低连接效率。所以你要么
不用gel purification，如果必须分离两个片段，你可以
同时在两条LANE上跑少量的DNA和大量的DNA，切下少量DNA的
胶用UV照射确定所要片段的位置。