关于qRT-PCR# Biology - 生物学
f*i
1 楼
本人绿卡刚刚下来，目前工作单位的资料还是H-1B身份，最近想邀请父母过来探亲，请
问是不是提供自己H-1B身份好一些，如果提供绿卡身份会不会对父母签证有影响，容易
悲剧啊？
问是不是提供自己H-1B身份好一些，如果提供绿卡身份会不会对父母签证有影响，容易
悲剧啊？
y*i
2 楼
【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: chencu (陈醋), 信区: SanDiego
标 题: Re: LA今天地震了
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 16 16:41:18 2010, 美东)
http://www.costco.com/Browse/Product.aspx?
Prodid=11280341&search=emergency%20kit&Mo=56&cm_re=1_en-_-Top_Left_Nav-_-
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US&Nr=P_CatalogName:BC&Sp=S&N=5000043&whse=BC&Dx=mode+matchallpartial&Ntk=
Text_Search&Dr=
P_CatalogName:BC&Ne=4000000&D=emergency%20kit&Ntt=emergency%20kit&No=0&Ntx=
mode+matchallp
artial&Nty=1&topnav=&s=1
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发信人: chencu (陈醋), 信区: SanDiego
标 题: Re: LA今天地震了
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 16 16:41:18 2010, 美东)
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r*y
3 楼
有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
恳请大家不吝赐教
恳请大家不吝赐教
F*u
4 楼
有些人不知道脑子里一天想些什么
【在 f*********i 的大作中提到】
: 本人绿卡刚刚下来，目前工作单位的资料还是H-1B身份，最近想邀请父母过来探亲，请
: 问是不是提供自己H-1B身份好一些，如果提供绿卡身份会不会对父母签证有影响，容易
: 悲剧啊？
【在 f*********i 的大作中提到】
: 本人绿卡刚刚下来，目前工作单位的资料还是H-1B身份，最近想邀请父母过来探亲，请
: 问是不是提供自己H-1B身份好一些，如果提供绿卡身份会不会对父母签证有影响，容易
: 悲剧啊？
f*8
5 楼
如果有这个，还是应该备好的吧。
【在 y***i 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
: 发信人: chencu (陈醋), 信区: SanDiego
: 标 题: Re: LA今天地震了
: 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 16 16:41:18 2010, 美东)
: http://www.costco.com/Browse/Product.aspx?
: Prodid=11280341&search=emergency%20kit&Mo=56&cm_re=1_en-_-Top_Left_Nav-_-
: Top_search&lang=en-
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: Text_Search&Dr=
: P_CatalogName:BC&Ne=4000000&D=emergency%20kit&Ntt=emergency%20kit&No=0&Ntx=
c*r
6 楼
理论上说，用delta ct算差别的前提是amplification efficiency是100%，所以一个
cycle是两倍。如果你的efficiency不是2，比如是1.85，那么3个cycle就是2^3和1.85^
3的差别，也就是说实际6.33倍的差别被当成了8倍的差别。这是你的internal control
。如果用这个去adjust你的target的差别，加上target本身的efficiency如果也不是
100%，这个真正的差别就会非常大。
第二个问题是amplification是S型曲线，就是说，在开始阶段，或者在东西很少的不在
中间一段linear范围内的时候不能用delta delta Ct。
我的意思是，cell number不是可信与否的关键，关键是amplification efficiency。
在你怀疑你的结果是否可信的时候，建议用standard curve instead of delta delta
Ct来计算。只要你的sample的Ct落在你的standard curve里面，而你的standard curve
的correlation ef
【在 r********y 的大作中提到】
: 有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
: 恳请大家不吝赐教
cycle是两倍。如果你的efficiency不是2，比如是1.85，那么3个cycle就是2^3和1.85^
3的差别，也就是说实际6.33倍的差别被当成了8倍的差别。这是你的internal control
。如果用这个去adjust你的target的差别，加上target本身的efficiency如果也不是
100%，这个真正的差别就会非常大。
第二个问题是amplification是S型曲线，就是说，在开始阶段，或者在东西很少的不在
中间一段linear范围内的时候不能用delta delta Ct。
我的意思是，cell number不是可信与否的关键，关键是amplification efficiency。
在你怀疑你的结果是否可信的时候，建议用standard curve instead of delta delta
Ct来计算。只要你的sample的Ct落在你的standard curve里面，而你的standard curve
的correlation ef
【在 r********y 的大作中提到】
: 有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
: 恳请大家不吝赐教
f*i
7 楼
能否给个答案呢？
【在 F*********u 的大作中提到】
: 有些人不知道脑子里一天想些什么
【在 F*********u 的大作中提到】
: 有些人不知道脑子里一天想些什么
r*y
8 楼
非常感谢，是不是说，如果primer 的amplification efficiency比较高的前提下，这
种差别是可以接受的？
另外一个问题是，您在使用standard curve的时候，每次都要重新做standard curve
还是reuse（我知道，理论上讲，应当每次都要重新做标准曲线，但是我们的target
gene 比较多，每次都要做standard curve 比较困难）
85^
control
delta
curve
【在 c******r 的大作中提到】
: 理论上说，用delta ct算差别的前提是amplification efficiency是100%，所以一个
: cycle是两倍。如果你的efficiency不是2，比如是1.85，那么3个cycle就是2^3和1.85^
: 3的差别，也就是说实际6.33倍的差别被当成了8倍的差别。这是你的internal control
: 。如果用这个去adjust你的target的差别，加上target本身的efficiency如果也不是
: 100%，这个真正的差别就会非常大。
: 第二个问题是amplification是S型曲线，就是说，在开始阶段，或者在东西很少的不在
: 中间一段linear范围内的时候不能用delta delta Ct。
: 我的意思是，cell number不是可信与否的关键，关键是amplification efficiency。
: 在你怀疑你的结果是否可信的时候，建议用standard curve instead of delta delta
: Ct来计算。只要你的sample的Ct落在你的standard curve里面，而你的standard curve
种差别是可以接受的？
另外一个问题是，您在使用standard curve的时候，每次都要重新做standard curve
还是reuse（我知道，理论上讲，应当每次都要重新做标准曲线，但是我们的target
gene 比较多，每次都要做standard curve 比较困难）
85^
control
delta
curve
【在 c******r 的大作中提到】
: 理论上说，用delta ct算差别的前提是amplification efficiency是100%，所以一个
: cycle是两倍。如果你的efficiency不是2，比如是1.85，那么3个cycle就是2^3和1.85^
: 3的差别，也就是说实际6.33倍的差别被当成了8倍的差别。这是你的internal control
: 。如果用这个去adjust你的target的差别，加上target本身的efficiency如果也不是
: 100%，这个真正的差别就会非常大。
: 第二个问题是amplification是S型曲线，就是说，在开始阶段，或者在东西很少的不在
: 中间一段linear范围内的时候不能用delta delta Ct。
: 我的意思是，cell number不是可信与否的关键，关键是amplification efficiency。
: 在你怀疑你的结果是否可信的时候，建议用standard curve instead of delta delta
: Ct来计算。只要你的sample的Ct落在你的standard curve里面，而你的standard curve
d*e
9 楼
没关系
【在 f*********i 的大作中提到】
: 能否给个答案呢？
【在 f*********i 的大作中提到】
: 能否给个答案呢？
c*r
10 楼
我想应该是可以的。
如果target比较多，每次一个个run standard curve确实很麻烦，也很浪费。
如果不得不comprimise， 我想能不能每个target先run几遍standard curve，make
sure the amplification efficiency varies in an acceptable range。这个可以直
接得出efficiency的average和std。这样以后run的时候不再run target的standard
curve，而是只run一个internal control的standard curve。通过refer你前面的
standard curve中的internal control来确定你的PCR run at optimal efficiency。
而且make sure你的target的Ct fall into你的linear range。
反正就是想点办法吧，你觉得这样行不行？
这种事情每人情况不一样，反正需要自己设计实验让它能够reasonablely convincing
就好了。
【在 r********y 的大作中提到】
: 非常感谢，是不是说，如果primer 的amplification efficiency比较高的前提下，这
: 种差别是可以接受的？
: 另外一个问题是，您在使用standard curve的时候，每次都要重新做standard curve
: 还是reuse（我知道，理论上讲，应当每次都要重新做标准曲线，但是我们的target
: gene 比较多，每次都要做standard curve 比较困难）
:
: 85^
: control
: delta
: curve
如果target比较多，每次一个个run standard curve确实很麻烦，也很浪费。
如果不得不comprimise， 我想能不能每个target先run几遍standard curve，make
sure the amplification efficiency varies in an acceptable range。这个可以直
接得出efficiency的average和std。这样以后run的时候不再run target的standard
curve，而是只run一个internal control的standard curve。通过refer你前面的
standard curve中的internal control来确定你的PCR run at optimal efficiency。
而且make sure你的target的Ct fall into你的linear range。
反正就是想点办法吧，你觉得这样行不行？
这种事情每人情况不一样，反正需要自己设计实验让它能够reasonablely convincing
就好了。
【在 r********y 的大作中提到】
: 非常感谢，是不是说，如果primer 的amplification efficiency比较高的前提下，这
: 种差别是可以接受的？
: 另外一个问题是，您在使用standard curve的时候，每次都要重新做standard curve
: 还是reuse（我知道，理论上讲，应当每次都要重新做标准曲线，但是我们的target
: gene 比较多，每次都要做standard curve 比较困难）
:
: 85^
: control
: delta
: curve
r*y
11 楼
我也觉得这样算是最为可行的了。谢谢大牛！
convincing
【在 c******r 的大作中提到】
: 我想应该是可以的。
: 如果target比较多，每次一个个run standard curve确实很麻烦，也很浪费。
: 如果不得不comprimise， 我想能不能每个target先run几遍standard curve，make
: sure the amplification efficiency varies in an acceptable range。这个可以直
: 接得出efficiency的average和std。这样以后run的时候不再run target的standard
: curve，而是只run一个internal control的standard curve。通过refer你前面的
: standard curve中的internal control来确定你的PCR run at optimal efficiency。
: 而且make sure你的target的Ct fall into你的linear range。
: 反正就是想点办法吧，你觉得这样行不行？
: 这种事情每人情况不一样，反正需要自己设计实验让它能够reasonablely convincing
convincing
【在 c******r 的大作中提到】
: 我想应该是可以的。
: 如果target比较多，每次一个个run standard curve确实很麻烦，也很浪费。
: 如果不得不comprimise， 我想能不能每个target先run几遍standard curve，make
: sure the amplification efficiency varies in an acceptable range。这个可以直
: 接得出efficiency的average和std。这样以后run的时候不再run target的standard
: curve，而是只run一个internal control的standard curve。通过refer你前面的
: standard curve中的internal control来确定你的PCR run at optimal efficiency。
: 而且make sure你的target的Ct fall into你的linear range。
: 反正就是想点办法吧，你觉得这样行不行？
: 这种事情每人情况不一样，反正需要自己设计实验让它能够reasonablely convincing
m*2
12 楼
clonbar说的很详细，我补充一点。这个最终要看你的样品之间的区别。比如说处理和
对照之间如果是
成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
后的可信度也不
高。
我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
约5000
cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
的RNA 都
用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于
30 个
cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
【在 r********y 的大作中提到】
: 有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
: 恳请大家不吝赐教
对照之间如果是
成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
后的可信度也不
高。
我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
约5000
cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
的RNA 都
用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于
30 个
cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
【在 r********y 的大作中提到】
: 有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
: 恳请大家不吝赐教
w*a
13 楼
nod,大部分qPCR结果差个20～30%都是搞笑。特别是delta delta Ct方法算出来的。
【在 m**********2 的大作中提到】
: clonbar说的很详细，我补充一点。这个最终要看你的样品之间的区别。比如说处理和
: 对照之间如果是
: 成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
: 如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
: 后的可信度也不
: 高。
: 我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
:
: 约5000
: cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
【在 m**********2 的大作中提到】
: clonbar说的很详细，我补充一点。这个最终要看你的样品之间的区别。比如说处理和
: 对照之间如果是
: 成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
: 如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
: 后的可信度也不
: 高。
: 我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
:
: 约5000
: cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
c*r
14 楼
nod，nod，太对了。
Ct值只给出两位数，所以最小差别是0.01个Ct，按照最后一位是不精确估计的考虑，最多只能0.1个Ct的差别可以准确区分。
2^(1+-0.1)=1.86 ~ 2.14。
就是说20%以内的差别都可能是不可避免的系统误差，没有任何意义，吼吼
【在 m**********2 的大作中提到】
: clonbar说的很详细，我补充一点。这个最终要看你的样品之间的区别。比如说处理和
: 对照之间如果是
: 成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
: 如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
: 后的可信度也不
: 高。
: 我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
:
: 约5000
: cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
Ct值只给出两位数，所以最小差别是0.01个Ct，按照最后一位是不精确估计的考虑，最多只能0.1个Ct的差别可以准确区分。
2^(1+-0.1)=1.86 ~ 2.14。
就是说20%以内的差别都可能是不可避免的系统误差，没有任何意义，吼吼
【在 m**********2 的大作中提到】
: clonbar说的很详细，我补充一点。这个最终要看你的样品之间的区别。比如说处理和
: 对照之间如果是
: 成百上千倍的区别，那么你的内参和目标基因的差别就无关大局。
: 如果你的处理和对照之间只有一两倍的区别，或者更小，那倒不用费这个劲了。反正最
: 后的可信度也不
: 高。
: 我倒是经常碰到有人煞有介事的说这个比那个高20%--那就更搞笑了。
:
: 约5000
: cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以
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