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请教一个非常规实验（大载体连接）手段是否可行

请教一个非常规实验（大载体连接）手段是否可行# Biology - 生物学

b*72010-10-30 07:10

1 楼

可能会于年底去加拿大开会。
但是我的h1b entry visa已经过期了。
在网上查了下，好像我这种情况符合所谓的automatic revalidation.
想问一下，这个provision现在是不是还有效？
谨慎一点。

u*l2010-10-30 07:10

2 楼

是啥道理？

m*52010-10-30 07:10

3 楼

现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
端，于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么?　另外　，ＬＡ　Ｔａｑ引入突变的几率大么
另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／

S*I2010-10-30 07:10

4 楼

有效

【在 b*********7 的大作中提到】

: 可能会于年底去加拿大开会。
: 但是我的h1b entry visa已经过期了。
: 在网上查了下，好像我这种情况符合所谓的automatic revalidation.
: 想问一下，这个provision现在是不是还有效？
: 谨慎一点。

t*b2010-10-30 07:10

5 楼

这个片子目前没有在电视台放，是通过其他渠道流出的。

g*12010-10-30 07:10

6 楼

不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。

b*72010-10-30 07:10

7 楼

Thanks

【在 S**I 的大作中提到】

: 有效

u*l2010-10-30 07:10

8 楼

难怪，个人嚼着很好看

【在 t**b 的大作中提到】

: 这个片子目前没有在电视台放，是通过其他渠道流出的。

o*r2010-10-30 07:10

9 楼

以前有那种定点mutagenesis的protocol，用含mutation的primers和high fidality的
polymerase做linear amplification，然后用只切methylated DNA的RE处理，再
transformation。这样以后想怎么用都行。
现在不用这个protocol了？

L*d2010-10-30 07:10

10 楼

好像只适用于陆路去的

F*y2010-10-30 07:10

11 楼

我看youtube貌似是台湾电视台播的

g*12010-10-30 07:10

12 楼

他要加至少6个碱基进去，用mutagenesis恐怕不行吧

f*n2010-10-30 07:10

13 楼

nope

【在 L*******d 的大作中提到】

: 好像只适用于陆路去的

V*82010-10-30 07:10

14 楼

看了两集睡着了。。。

o*r2010-10-30 07:10

15 楼

没必要6个全改吧。。。

【在 g******1 的大作中提到】

: 他要加至少6个碱基进去，用mutagenesis恐怕不行吧

b*r2010-10-30 07:10

16 楼

施公案已经到三十级了

【在 u**********l 的大作中提到】

: 是啥道理？

m*52010-10-30 07:10

17 楼

这个我做过，但没在这么大的质粒上做过……

【在 o********r 的大作中提到】

: 以前有那种定点mutagenesis的protocol，用含mutation的primers和high fidality的
: polymerase做linear amplification，然后用只切methylated DNA的RE处理，再
: transformation。这样以后想怎么用都行。
: 现在不用这个protocol了？

a*t2010-10-30 07:10

18 楼

啊？那天线宝那里有没更新啊？

【在 b****r 的大作中提到】

: 施公案已经到三十级了

s*y2010-10-30 07:10

19 楼

Not a good idea.
It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
restriction site.

【在 m******5 的大作中提到】

: 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
: 物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
: 端，于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么?　另外　，ＬＡ　Ｔａｑ引入突变的几率大么
: 另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／

S*a2010-10-30 07:10

20 楼

我已经等了好几周了，一直告诉自己淡定

o*r2010-10-30 07:10

21 楼

这个和你想P出来原理基本上一样，差别是一个用E coli来扩增，一个用PCR，我还是相
信E coli多些

【在 m******5 的大作中提到】

: 这个我做过，但没在这么大的质粒上做过……

m*d2010-10-30 07:10

22 楼

估计被广大皇汉给灭了吧，像大漠谣一样
不过也是个烂片

【在 u**********l 的大作中提到】

: 是啥道理？

n*k2010-10-30 07:10

23 楼

simply modify the vector first by fusion PCR (about anywhere 200bp-1kb)
introducing the desired cut site at
the desired position...and then do whatever you want...I would't trust any
PCR with a 13KB template without
sequencing...if u are luck, everything might be alright but u could end up
in dark having no clue what's gone
wrong...If you want to do the cloning in a single step which I won't
recommend if not an experienced one, just
go three piece or even four piece ligation... that way, u might just get
around the problem or introducing the
cut site and the insert at a same time...Anyway, the fact is in most if not
all scenarios, one could always find
alternative ways to do clonings.. I have yet run into any cloning I could
not come up with an alternative
strategy...and a last comment: sometimes detour is shortcut

【在 m******5 的大作中提到】

t*b2010-10-30 07:10

24 楼

更新了啊：
http://v.netstartv.com/watch/1797

【在 a******t 的大作中提到】

: 啊？那天线宝那里有没更新啊？

f*e2010-10-30 07:10

25 楼

if he can insert MCS easily, he also can put his gene or some element into t
he single cut backbone.
i think the pcr protocol for such a big plasmid is not a good idea. why not
try enough enzyme digestion and dephosphate the backbone, in principle, 50%
ligation would be correct.

multiple

【在 s******y 的大作中提到】

: Not a good idea.
: It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
: restriction site.