问个phusion和TA cloning# Biology - 生物学
e*r
1 楼
父母延期后拿到新的I-94卡，回国登记的时候在登机口，工作人员只收了旧的I-94卡（
给新的他们不要，不知什么原因），有哪位兄弟姐妹遇到过类似问题吗？是不是需要把
新的I-94卡寄回海关啊？
谢谢了！
给新的他们不要，不知什么原因），有哪位兄弟姐妹遇到过类似问题吗？是不是需要把
新的I-94卡寄回海关啊？
谢谢了！
c*l
2 楼
该死的B & N，早不通知！
下地狱，下地狱！
下地狱，下地狱！
n*w
3 楼
需要用pGEM T-easy这个vector,
pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
问一下3'端加A，
我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
）。
我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
。。。
请有经验的说说。
谢谢～～
pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
问一下3'端加A，
我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
）。
我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
。。。
请有经验的说说。
谢谢～～
l*n
4 楼
首先，登机口收i-94纯属鬼扯，登机口只检查登机牌。 其次，i－94离开美国后就是废
纸一张，寄回海关，海关人员收到后骂了一句stupid然后扔到垃圾堆里去了。
【在 e*******r 的大作中提到】
: 父母延期后拿到新的I-94卡，回国登记的时候在登机口，工作人员只收了旧的I-94卡（
: 给新的他们不要，不知什么原因），有哪位兄弟姐妹遇到过类似问题吗？是不是需要把
: 新的I-94卡寄回海关啊？
: 谢谢了！
纸一张，寄回海关，海关人员收到后骂了一句stupid然后扔到垃圾堆里去了。
【在 e*******r 的大作中提到】
: 父母延期后拿到新的I-94卡，回国登记的时候在登机口，工作人员只收了旧的I-94卡（
: 给新的他们不要，不知什么原因），有哪位兄弟姐妹遇到过类似问题吗？是不是需要把
: 新的I-94卡寄回海关啊？
: 谢谢了！
f*i
5 楼
问题是他们家在我信用卡上的扣款一直pending，占用额度
这尼玛太坑爹了
这尼玛太坑爹了
B*o
6 楼
可以用 TOPO blunt end cloning先做了再转嘛
按照phusion的说明书，你得纯化。至于加A overhang的效率咋样，俺就不清楚了
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
按照phusion的说明书，你得纯化。至于加A overhang的效率咋样，俺就不清楚了
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
E*e
7 楼
现在没有了以前的那种纸质的I-94卡了吧，都是电子系统，网上查询的。回国登机办登
机手续时也不用收I-94卡了。
延期的I-94卡最好还是留着，下次签证的时候可能会用得着。
机手续时也不用收I-94卡了。
延期的I-94卡最好还是留着，下次签证的时候可能会用得着。
H*7
8 楼
神户，你好
【在 f*******i 的大作中提到】
: 问题是他们家在我信用卡上的扣款一直pending，占用额度
: 这尼玛太坑爹了
【在 f*******i 的大作中提到】
: 问题是他们家在我信用卡上的扣款一直pending，占用额度
: 这尼玛太坑爹了
h*r
9 楼
先纯化，然后加taq的buffer例如thermo,不加引物，加dNTP或dATP.72都或者68度。
其实纯化时可以不用EB buffer，把taq酶的10Xbuffer,稀释到5X或3X,直接洗下来，然
后最终配到1X反应就可以了。
其实纯化时可以不用EB buffer，把taq酶的10Xbuffer,稀释到5X或3X,直接洗下来，然
后最终配到1X反应就可以了。
w*u
10 楼
BN就是垃圾
n*w
11 楼
我现在用的protocol就是：
purified dna: 10ul (1ug)
dATP (10mM): 1ul
10x taq buffer: 5ul
MgCl2 (50mM): 1.5ul
Taq: 0.2
add dH2O up to 50ul
72 degree for 20min
我没理解你最后说的意思。
你是说用phusion做完纯化最后一步用稀释的Taq buffer洗？
谢谢。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 先纯化，然后加taq的buffer例如thermo,不加引物，加dNTP或dATP.72都或者68度。
: 其实纯化时可以不用EB buffer，把taq酶的10Xbuffer,稀释到5X或3X,直接洗下来，然
: 后最终配到1X反应就可以了。
purified dna: 10ul (1ug)
dATP (10mM): 1ul
10x taq buffer: 5ul
MgCl2 (50mM): 1.5ul
Taq: 0.2
add dH2O up to 50ul
72 degree for 20min
我没理解你最后说的意思。
你是说用phusion做完纯化最后一步用稀释的Taq buffer洗？
谢谢。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 先纯化，然后加taq的buffer例如thermo,不加引物，加dNTP或dATP.72都或者68度。
: 其实纯化时可以不用EB buffer，把taq酶的10Xbuffer,稀释到5X或3X,直接洗下来，然
: 后最终配到1X反应就可以了。
h*r
12 楼
你的应该没问题吧。对的，我的意思是可以用稀释的Taq buffer洗，taq buffer 一般
也是碱性的。保证reacttion mix是1X的就可以了。
因为我以前的洗脱体积有点大，感觉反应的时候最后都是EB buffer，不是reaction
buffer.虽然EB buffer应该没啥影响。
就用了稀释的taq buffer,当然不含mgcl2,dNTP啥的。
也是碱性的。保证reacttion mix是1X的就可以了。
因为我以前的洗脱体积有点大，感觉反应的时候最后都是EB buffer，不是reaction
buffer.虽然EB buffer应该没啥影响。
就用了稀释的taq buffer,当然不含mgcl2,dNTP啥的。
n*w
13 楼
谢谢。然后加完A后就可以直接做ligation了？还是说再纯化。。。？
h*r
14 楼
你的应该没问题吧。对的，我的意思是可以用稀释的Taq buffer洗，taq buffer 一般
也是碱性的。保证reacttion mix是1X的就可以了。
因为我以前的洗脱体积有点大，感觉反应的时候最后都是EB buffer，不是reaction
buffer.虽然EB buffer应该没啥影响。
就用了稀释的taq buffer,当然不含mgcl2,dNTP啥的。
也是碱性的。保证reacttion mix是1X的就可以了。
因为我以前的洗脱体积有点大，感觉反应的时候最后都是EB buffer，不是reaction
buffer.虽然EB buffer应该没啥影响。
就用了稀释的taq buffer,当然不含mgcl2,dNTP啥的。
s*8
15 楼
最近试了一下phusion+topo cloning,我也是PCR纯化后加taq 20分钟,但是连不上.
我理解如果PCR纯化过了再加A,就不用再纯化了.
如果PCR完了直接加A,马上topo clone,应该也可以 (according to topo manual),但是我没试过,哪位试过的同学来说说?
我理解如果PCR纯化过了再加A,就不用再纯化了.
如果PCR完了直接加A,马上topo clone,应该也可以 (according to topo manual),但是我没试过,哪位试过的同学来说说?
s*s
16 楼
加A以后直接用。
是我没试过,哪位试过的同学来说说?
【在 s********8 的大作中提到】
: 最近试了一下phusion+topo cloning,我也是PCR纯化后加taq 20分钟,但是连不上.
: 我理解如果PCR纯化过了再加A,就不用再纯化了.
: 如果PCR完了直接加A,马上topo clone,应该也可以 (according to topo manual),但是我没试过,哪位试过的同学来说说?
是我没试过,哪位试过的同学来说说?
【在 s********8 的大作中提到】
: 最近试了一下phusion+topo cloning,我也是PCR纯化后加taq 20分钟,但是连不上.
: 我理解如果PCR纯化过了再加A,就不用再纯化了.
: 如果PCR完了直接加A,马上topo clone,应该也可以 (according to topo manual),但是我没试过,哪位试过的同学来说说?
e*r
17 楼
酶没有灭活
被抹平了吧
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
被抹平了吧
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
i*g
18 楼
先gel extraction 纯化了，然后ex-taq 处理，不要加ddH2O，用dNTP， taq 用正常200-300%量
72C 20min 后，过Qiagen spin column，然后立即使用
据说T vector和这种 A-overhang insert都不耐放。
72C 20min 后，过Qiagen spin column，然后立即使用
据说T vector和这种 A-overhang insert都不耐放。
b*s
19 楼
理论上是不是加上的3' overhang可以大于等于1？
如果这样必须测序确定具体数目防止后续克隆有移码？
200-300%量
【在 i*****g 的大作中提到】
: 先gel extraction 纯化了，然后ex-taq 处理，不要加ddH2O，用dNTP， taq 用正常200-300%量
: 72C 20min 后，过Qiagen spin column，然后立即使用
: 据说T vector和这种 A-overhang insert都不耐放。
如果这样必须测序确定具体数目防止后续克隆有移码？
200-300%量
【在 i*****g 的大作中提到】
: 先gel extraction 纯化了，然后ex-taq 处理，不要加ddH2O，用dNTP， taq 用正常200-300%量
: 72C 20min 后，过Qiagen spin column，然后立即使用
: 据说T vector和这种 A-overhang insert都不耐放。
s*n
20 楼
Statagene好像有一个Pfu是高保真但同时能加A的；Lucigen有GC cloning vector，据
说效率比TA要高不少。
说效率比TA要高不少。
d*y
21 楼
phusion后純化一下。然後taq加A。加完A后就不要純化了，直接拿去做轉化，用化學感
受態的ecoli就可以了。
受態的ecoli就可以了。
n*w
22 楼
yes, this works.
I've sent samples for sequencing.
【在 d***y 的大作中提到】
: phusion后純化一下。然後taq加A。加完A后就不要純化了，直接拿去做轉化，用化學感
: 受態的ecoli就可以了。
I've sent samples for sequencing.
【在 d***y 的大作中提到】
: phusion后純化一下。然後taq加A。加完A后就不要純化了，直接拿去做轉化，用化學感
: 受態的ecoli就可以了。
c*b
23 楼
I usually use this enzyme:
FideliTaq DNA Polymerase http://www.affymetrix.com/estore/browse/level_three_category_and_products.jsp;jsessionid=33D79F26865C7C6B365A56E7B058B815?category=35714&categoryIdClicked=35714&expand=true&parent=35635
It is high fidelity and strong activity, and it adds A as well. So far I had
no problem with cloning genes up to 3 kb.
There is also a cheap and strong regular Taq from Genscript: Green Taq DNA
Polymerase
http://www.genscript.com/green_pcr.html
This one has strong activity, and somehow good fidelity for fragment less
than 1 kb. Besides, it is very cheap, unless you purify taq urself.
Good luck.
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
FideliTaq DNA Polymerase http://www.affymetrix.com/estore/browse/level_three_category_and_products.jsp;jsessionid=33D79F26865C7C6B365A56E7B058B815?category=35714&categoryIdClicked=35714&expand=true&parent=35635
It is high fidelity and strong activity, and it adds A as well. So far I had
no problem with cloning genes up to 3 kb.
There is also a cheap and strong regular Taq from Genscript: Green Taq DNA
Polymerase
http://www.genscript.com/green_pcr.html
This one has strong activity, and somehow good fidelity for fragment less
than 1 kb. Besides, it is very cheap, unless you purify taq urself.
Good luck.
【在 n***w 的大作中提到】
: 需要用pGEM T-easy这个vector,
: pcr是用phusion做的，得到的是blunt end,
: 问一下3'端加A，
: 我是直接在PCR reaction里加一点taq呢（看thermo网站说加A前纯化很重要。。。）？
: 还是说purify以后再用taq，72度20分钟（这一步还要纯化吗？还是直接可以往下做？
: ）。
: 我上次用了purified的和taq一起，然后纯化了，然后TA，结果没连上，都是载体自连
: 。。。
: 请有经验的说说。
: 谢谢～～
s*n
24 楼
Green Taq不错，我都用来做PCR screening.
had
【在 c********b 的大作中提到】
: I usually use this enzyme:
: FideliTaq DNA Polymerase http://www.affymetrix.com/estore/browse/level_three_category_and_products.jsp;jsessionid=33D79F26865C7C6B365A56E7B058B815?category=35714&categoryIdClicked=35714&expand=true&parent=35635
: It is high fidelity and strong activity, and it adds A as well. So far I had
: no problem with cloning genes up to 3 kb.
: There is also a cheap and strong regular Taq from Genscript: Green Taq DNA
: Polymerase
: http://www.genscript.com/green_pcr.html
: This one has strong activity, and somehow good fidelity for fragment less
: than 1 kb. Besides, it is very cheap, unless you purify taq urself.
: Good luck.
had
【在 c********b 的大作中提到】
: I usually use this enzyme:
: FideliTaq DNA Polymerase http://www.affymetrix.com/estore/browse/level_three_category_and_products.jsp;jsessionid=33D79F26865C7C6B365A56E7B058B815?category=35714&categoryIdClicked=35714&expand=true&parent=35635
: It is high fidelity and strong activity, and it adds A as well. So far I had
: no problem with cloning genes up to 3 kb.
: There is also a cheap and strong regular Taq from Genscript: Green Taq DNA
: Polymerase
: http://www.genscript.com/green_pcr.html
: This one has strong activity, and somehow good fidelity for fragment less
: than 1 kb. Besides, it is very cheap, unless you purify taq urself.
: Good luck.
s*8
25 楼
看来我做不出来还是片断太大了。。。
【在 n***w 的大作中提到】
: yes, this works.
: I've sent samples for sequencing.
【在 n***w 的大作中提到】
: yes, this works.
: I've sent samples for sequencing.
z*6
26 楼
嗯，上面说的那个方法也可以（就是你成功的这个方法）。。。
还有一种方法就是直接用blunt end的T vector，也很好用，不过我不知道哪个公司卖
。。。
还有一种方法就是直接用blunt end的T vector，也很好用，不过我不知道哪个公司卖
。。。
n*w
27 楼
could be, mine is about 2.5kb.
【在 s********8 的大作中提到】
: 看来我做不出来还是片断太大了。。。
【在 s********8 的大作中提到】
: 看来我做不出来还是片断太大了。。。
n*w
28 楼
probably TOPO from Invitrogen.
【在 z*******6 的大作中提到】
: 嗯，上面说的那个方法也可以（就是你成功的这个方法）。。。
: 还有一种方法就是直接用blunt end的T vector，也很好用，不过我不知道哪个公司卖
: 。。。
【在 z*******6 的大作中提到】
: 嗯，上面说的那个方法也可以（就是你成功的这个方法）。。。
: 还有一种方法就是直接用blunt end的T vector，也很好用，不过我不知道哪个公司卖
: 。。。
k*l
29 楼
Invitrogen PCR blunt
【在 n***w 的大作中提到】
: probably TOPO from Invitrogen.
【在 n***w 的大作中提到】
: probably TOPO from Invitrogen.
i*g
30 楼
2.5k 还可以做的，要是PCR 产物量少，就麻烦了。
你不能直接用 dATP +A
要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
你不能直接用 dATP +A
要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
s*8
31 楼
这样啊,可是topo 的manual上说的是加dATP啊?
下次试试dNTP吧!
【在 i*****g 的大作中提到】
: 2.5k 还可以做的，要是PCR 产物量少，就麻烦了。
: 你不能直接用 dATP +A
: 要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
下次试试dNTP吧!
【在 i*****g 的大作中提到】
: 2.5k 还可以做的，要是PCR 产物量少，就麻烦了。
: 你不能直接用 dATP +A
: 要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
s*n
32 楼
Taq没有3'-exo活性
【在 i*****g 的大作中提到】
: 2.5k 还可以做的，要是PCR 产物量少，就麻烦了。
: 你不能直接用 dATP +A
: 要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
【在 i*****g 的大作中提到】
: 2.5k 还可以做的，要是PCR 产物量少，就麻烦了。
: 你不能直接用 dATP +A
: 要用dNTP, DNApol的特点是无外来dNTP，会降解DNA，直到碱基A为止
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