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十万火急，求鉴定real-time PCR 的扩增曲线

十万火急，求鉴定real-time PCR 的扩增曲线# Biology - 生物学

z*x2012-04-25 07:04

1 楼

本人现在一state univ 作 research associate (不太稳定)，现有两种选择：
1) already an offer, 社区大学一pre engineering INSTRUCTOR， 48K/YEAR，要马
上做决定(要开学
了， H1B TRANSFER 自己掏银子。。)
2) 一可能OFFER，国家级研究机构POSTDOC两年，最近一个月才能有消息，在DC；
如何抉择，纠结呀纠结................

c*u2012-04-25 07:04

2 楼

谢谢.

g*n2012-04-25 07:04

3 楼

C*d2012-04-25 07:04

4 楼

第一次用real-time PCR，身边又没人会
一组实验，得到如图扩增曲线。
plot based Rn,含标准DNA的样品，似乎是扩增了的
如果plots based on dRN,含标准样的DNA没扩增，且没有CT值
求解？
做这个东西，一个多月了，始终没得不到好的扩增曲线，烦啊

c*t2012-04-25 07:04

5 楼

这个选择肯定跟本人的性格有关
要是我我就选择等 2

O*O2012-04-25 07:04

6 楼

俺的case是2/17送达，3/4收到email通知

【在 c***u 的大作中提到】

: 谢谢.

c*o2012-04-25 07:04

7 楼

解说千篇一律，配乐比较牛逼。

【在 g****n 的大作中提到】

C*d2012-04-25 07:04

8 楼

用的是Taqman probe
望高人指点

m*n2012-04-25 07:04

9 楼

一是dead end job吧，二还有点戏

【在 z*x 的大作中提到】

: 本人现在一state univ 作 research associate (不太稳定)，现有两种选择：
: 1) already an offer, 社区大学一pre engineering INSTRUCTOR， 48K/YEAR，要马
: 上做决定(要开学
: 了， H1B TRANSFER 自己掏银子。。)
: 2) 一可能OFFER，国家级研究机构POSTDOC两年，最近一个月才能有消息，在DC；
: 如何抉择，纠结呀纠结................

j*o2012-04-25 07:04

10 楼

a week for me

C*e2012-04-25 07:04

11 楼

没用过Taqman probe
不过光看你的曲线
第二个图里明显是baseline substraction那步有问题
没用过你的机子不熟悉
至少在bio-rad家的机子里是可以选择是哪几个cycles的平均值做baseline的
默认好像是2-8
可以改成2-7，2-6，2-5，再少好像就不行了，
但可以直接输入一个值作为baseline的矫正
不同机子处理大同小异
一般情况下这样取baseline没什么问题
因为很少那么早循环就起来的
但是你的standard template信号比较强（拷贝数比较多）
挺早曲线就抬起来了
再用default的方法做baseline什么的就会产生你图上的结果
就好象是倒下来的S一样的
其实就是因为前几轮里面信号已经不能被当成baseline值处理
更不能拿来做矫正
建议就是一个可以看看能不能调看哪几个cycle作为baseline调整的依据的
或者可不可以手动给一个值
如果说下次还要做这样的实验，建议稀释standard template，
根据你上面的结果，把它稀释到跟sample比较接近的区间
这样就算用default处理也不会有问题了

x*r2012-04-25 07:04

12 楼

但是他的 2 是 “可能”，还没有定。不然他肯定 2 了。

【在 c******t 的大作中提到】

: 这个选择肯定跟本人的性格有关
: 要是我我就选择等 2

C*d2012-04-25 07:04

13 楼

太感谢了！我再把机子的说明书，找来看看，应该是你说的原因
我还有一组分析，不同的probe和primer设计，那组实验，不管以Rn还是dRN，标准样都
得不到扩增曲线。烦请你帮我再分析分析。万分感谢。这事，折磨我一个月了。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 没用过Taqman probe
: 不过光看你的曲线
: 第二个图里明显是baseline substraction那步有问题
: 没用过你的机子不熟悉
: 至少在bio-rad家的机子里是可以选择是哪几个cycles的平均值做baseline的
: 默认好像是2-8
: 可以改成2-7，2-6，2-5，再少好像就不行了，
: 但可以直接输入一个值作为baseline的矫正
: 不同机子处理大同小异
: 一般情况下这样取baseline没什么问题

C*e2012-04-25 07:04

14 楼

这个。。。看起来好像没有扩增啊
你最后有没有跑个agarose gel看看
如果说有条带但是没信号的话再trouble shooting吧

【在 C******d 的大作中提到】

: 太感谢了！我再把机子的说明书，找来看看，应该是你说的原因
: 我还有一组分析，不同的probe和primer设计，那组实验，不管以Rn还是dRN，标准样都
: 得不到扩增曲线。烦请你帮我再分析分析。万分感谢。这事，折磨我一个月了。

C*d2012-04-25 07:04

15 楼

这一组，条带是有信号的。
我重复过几次，只有一个待测样品，得到了扩增曲线。但标准样，始终没有扩增曲线。
谢谢你的回复

【在 C*******e 的大作中提到】

: 这个。。。看起来好像没有扩增啊
: 你最后有没有跑个agarose gel看看
: 如果说有条带但是没信号的话再trouble shooting吧

C*e2012-04-25 07:04

16 楼

跑胶看看
其实即使做real-time也是应该跑胶的
做到心里有数

【在 C******d 的大作中提到】

: 这一组，条带是有信号的。
: 我重复过几次，只有一个待测样品，得到了扩增曲线。但标准样，始终没有扩增曲线。
: 谢谢你的回复