site mutagenesis遇到麻烦事了，# Biology - 生物学
l*7
1 楼
If anyone see him, please let him know, I am looking for him.
Thank you.
Thank you.
c*o
2 楼
rt
p*n
3 楼
据说，武汉的某墓地，有个人去扫墓，发现奇怪而且恐怖的哭声，
结果是树下埋着一个自动播放经文的播放器，中间还夹杂着哭声。
最后墓地管理员说，可以放这种播放器，但是不可以搞的太恐怖。
结果是树下埋着一个自动播放经文的播放器，中间还夹杂着哭声。
最后墓地管理员说，可以放这种播放器，但是不可以搞的太恐怖。
b*8
4 楼
要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？
析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？
u*9
5 楼
去文学城移民论坛喊喊，见他在那儿出现过、
祝好运
祝好运
r*g
6 楼
热
p*n
7 楼
【[费解]清明扫墓，男子听见无人的墓地里传来呜咽声，管理员：我们都听到过…】清
明将至，但武汉江夏市民夏先生不敢去给他的伯母扫墓。只因从前年下葬的时候开始，
他就隐隐听到墓丛中有人喃喃细语。去年他独自扫墓，又听到附近无人的墓丛中传来呜
咽声，吓得他汗毛倒竖，回家跟亲人讲大家都不信。记者找到公墓管理处，刚讲明来意
，公墓几名管理人员都表示听到过这种声音。那些讲话声、哭声其实是太阳能音箱发出
来的。这种小音箱可以反复播放经文，一些逝者的亲属买了音箱放在墓边，希望超度亡
灵。公墓管理人员并不知情。太阳能的音箱有时声音会很大很清晰，有时又会很模糊……
明将至，但武汉江夏市民夏先生不敢去给他的伯母扫墓。只因从前年下葬的时候开始，
他就隐隐听到墓丛中有人喃喃细语。去年他独自扫墓，又听到附近无人的墓丛中传来呜
咽声，吓得他汗毛倒竖，回家跟亲人讲大家都不信。记者找到公墓管理处，刚讲明来意
，公墓几名管理人员都表示听到过这种声音。那些讲话声、哭声其实是太阳能音箱发出
来的。这种小音箱可以反复播放经文，一些逝者的亲属买了音箱放在墓边，希望超度亡
灵。公墓管理人员并不知情。太阳能的音箱有时声音会很大很清晰，有时又会很模糊……
a*8
8 楼
try changing your PCR condition.
l*7
9 楼
I don't have account in wenxuecity, so I am afraid I can not post anything
there. Do you? Can you help me to post?
Thank you!
【在 u****9 的大作中提到】
: 去文学城移民论坛喊喊，见他在那儿出现过、
: 祝好运
there. Do you? Can you help me to post?
Thank you!
【在 u****9 的大作中提到】
: 去文学城移民论坛喊喊，见他在那儿出现过、
: 祝好运
a*k
10 楼
chi
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
r*n
11 楼
这也太恐怖了吧。
r*r
12 楼
why not try overlapping PCR?
l*t
13 楼
create an account, then you can post
T*e
14 楼
超
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
b*8
15 楼
目前用的是这个条件，
Pfu PCR reaction (1 reaction):
Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
Template (50ng) 1.0 μl
Pfu Ultra 0.5 μl
dNTP (25 mM) 0.5 μl
Buffer 2.5 μl
MilliQ 19.5 μl
25.0 μl
Thermal cycling condition:
95ºC 2 min
95ºC 30 sec
55ºC 30 sec
72ºC 4 min
25 cycles
72ºC 7 min
4ºC ∞
请问可以如何改进？
多谢关注和回复
Pfu PCR reaction (1 reaction):
Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
Template (50ng) 1.0 μl
Pfu Ultra 0.5 μl
dNTP (25 mM) 0.5 μl
Buffer 2.5 μl
MilliQ 19.5 μl
25.0 μl
Thermal cycling condition:
95ºC 2 min
95ºC 30 sec
55ºC 30 sec
72ºC 4 min
25 cycles
72ºC 7 min
4ºC ∞
请问可以如何改进？
多谢关注和回复
d*e
16 楼
ci
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
b*8
17 楼
Good idea。
Thanks
【在 r****r 的大作中提到】
: why not try overlapping PCR?
Thanks
【在 r****r 的大作中提到】
: why not try overlapping PCR?
t*k
18 楼
chi
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
s*n
19 楼
你确定这些条件是manual里建议的吗？
【在 b**********8 的大作中提到】
: 目前用的是这个条件，
: Pfu PCR reaction (1 reaction):
: Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
: Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
: Template (50ng) 1.0 μl
: Pfu Ultra 0.5 μl
: dNTP (25 mM) 0.5 μl
: Buffer 2.5 μl
: MilliQ 19.5 μl
: 25.0 μl
【在 b**********8 的大作中提到】
: 目前用的是这个条件，
: Pfu PCR reaction (1 reaction):
: Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
: Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
: Template (50ng) 1.0 μl
: Pfu Ultra 0.5 μl
: dNTP (25 mM) 0.5 μl
: Buffer 2.5 μl
: MilliQ 19.5 μl
: 25.0 μl
g*l
20 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
b*8
21 楼
可能有少少改动，但是我们组用这个条件已经很多年了，都挺顺利的，我之前也用过这
个方案做一个突变，效果挺好。这次同时做了4个位点的突变，3个都很顺利，唯独这一
个比较麻烦，重复过两次，唯一的改动是退火温度由53度升到55度，测序结果都发现虽
然突变成功，但是突变位点之后20bp开始出现大片段的mismatch
个方案做一个突变，效果挺好。这次同时做了4个位点的突变，3个都很顺利，唯独这一
个比较麻烦，重复过两次，唯一的改动是退火温度由53度升到55度，测序结果都发现虽
然突变成功，但是突变位点之后20bp开始出现大片段的mismatch
c*i
22 楼
chiachi
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
r*r
23 楼
could you send the mismatch sequence to BLAST and see what it really is?
sounds like a very interesting and robust recombination between DNA strands.
sounds like a very interesting and robust recombination between DNA strands.
f*t
24 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
L*t
25 楼
Extension太长了，减一半。Final Extension不要做
A*e
26 楼
chi
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
i*l
27 楼
gc% of your template?
seems it is from the features of your template, not the kit
try old school methods like 2 piece pcr........
【在 b**********8 的大作中提到】
: 要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
: 析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
: 序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？
seems it is from the features of your template, not the kit
try old school methods like 2 piece pcr........
【在 b**********8 的大作中提到】
: 要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
: 析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
: 序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？
d*e
28 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
b*8
29 楼
谢谢楼上各位回复。
回rosner ：突变后的序列基本上还是原来目的基因的序列，只不过突然出现了频繁的
mismatch
回Laforet：extension会影响结果吗？
回icool：质粒是一个基因的核心启动子序列连到PGL3-basic 上来的，GC含量确实很高
，70%以上。2 piece PCR 是否就是overlapping PCR？
再次感谢各位。
回rosner ：突变后的序列基本上还是原来目的基因的序列，只不过突然出现了频繁的
mismatch
回Laforet：extension会影响结果吗？
回icool：质粒是一个基因的核心启动子序列连到PGL3-basic 上来的，GC含量确实很高
，70%以上。2 piece PCR 是否就是overlapping PCR？
再次感谢各位。
p*f
30 楼
热
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
l*1
31 楼
>GC含量确实很高
加DMSO
or phusion PCR with DMSO
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31630741.html
加DMSO
or phusion PCR with DMSO
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31630741.html
K*n
32 楼
er
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
b*7
33 楼
chi
c*o
34 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
l*e
35 楼
re
l*e
36 楼
re
c*a
37 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
N*n
38 楼
钻风真狠，没有证据表明大钻做过什么坏事。
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
m*h
39 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
M*X
40 楼
chi
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
c*k
41 楼
re
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
【在 c*******o 的大作中提到】
: rt
i*a
42 楼
超, baozi
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