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关于shRNA transfection的一些问题，求解

关于shRNA transfection的一些问题，求解# Biology - 生物学

s*72012-08-13 07:08

1 楼

【以下文字转载自 Bella 俱乐部】
发信人: sail157 (Yang Fan), 信区: Bella
标题: 翻唱【问红尘】
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 1 22:35:41 2015, 美东)
简单哥说欢迎翻唱我就积极响应翻唱了 :)
http://app.box.com/s/9u2j8jhczuoddgin1e9jspsnz1mqq2ng
踏红尘恨平生
痴痴傻傻寂寞玉楼人
桃花红杨柳青
春入深闺溪上草青青
挥弦御风踏沙行
人去楼静暗香流花径
等闲赋诗易消魂
帘外轻轻依旧琴声紧
有道是泪沾襟
风风雨雨苦乐又一程
且长歌盼月明
庭院深深感怀伤我心
隔江遥寄一壶酒
今又苏醒塞外无乡音
千帆过尽无音信
冷冷清清别语愁难听
我挥弦我问情且弹且望
我挥弦问平生且歌且泣
每到黄昏泪雨过后尽是离别
如风飘零
弦音碎风莫负痴情人
有道是泪沾襟
MTV截图
MTV截图(3张)
风风雨雨苦乐又一程
且长歌盼月明
庭院深深感怀伤我心
隔江遥寄一壶酒
今又苏醒塞外无乡音
千帆过尽无音信
冷冷清清别语愁难听
我挥弦我问情且弹且望
我挥弦问平生且歌且泣
每到黄昏泪雨过后尽是离别
如风飘零
弦音碎风莫负痴情人
我挥弦我问情且弹且望
我挥弦问平生且歌且泣
每到黄昏泪雨过后尽是离别
如风飘零
弦音碎风莫负痴情人

E*s2012-08-13 07:08

2 楼

我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
因呢？
我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。

t*52012-08-13 07:08

3 楼

很好听，就是音质确实不太好，高频有些嘶嘶声，手机录的吗？

r*e2012-08-13 07:08

4 楼

主要是蛋白半衰期太长（PCR有效，WB不行），
另外可能蛋白抑制后，生长劣势（PCR， WB都不行），或者shRNA序列不行。

【在 E*****s 的大作中提到】

: 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
: 50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
: 因呢？
: 我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
: 稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
: 是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
: 新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。

E*s2012-08-13 07:08

5 楼

多谢！

a*x2012-08-13 07:08

6 楼

Try longer knock-down (6 days or more)

m*z2012-08-13 07:08

7 楼

shrna效率太低，换一个试试。另外蛋白太稳定，你用的transient还是lentivirus？

【在 E*****s 的大作中提到】

E*s2012-08-13 07:08

8 楼

不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
有puromycin的培养基筛选。
现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。

【在 m*****z 的大作中提到】

: shrna效率太低，换一个试试。另外蛋白太稳定，你用的transient还是lentivirus？

m*z2012-08-13 07:08

9 楼

那你用的什么approach

【在 E*****s 的大作中提到】

: 不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
: 有puromycin的培养基筛选。
: 现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。

b*s2012-08-13 07:08

10 楼

increase MOI
try harvest protein as early as possible, eg. 48hrs post-puromycin selection
.

b*82012-08-13 07:08

11 楼

也可以考虑换一个抗体试试。
我就在自己的project中发现，转导lentivirus shRNA后，qRT-PCR能看到70%以上的
knockdown，但是western没差。后来买了个识别C-terminus的抗体就能看到很明显的差
异（之前用的是识别N-terminus的抗体）。至今仍不解这是为什么，有大侠解释下么？

l*j2012-08-13 07:08

12 楼

是不是C-termi为功能区？

【在 b**********8 的大作中提到】

: 也可以考虑换一个抗体试试。
: 我就在自己的project中发现，转导lentivirus shRNA后，qRT-PCR能看到70%以上的
: knockdown，但是western没差。后来买了个识别C-terminus的抗体就能看到很明显的差
: 异（之前用的是识别N-terminus的抗体）。至今仍不解这是为什么，有大侠解释下么？

l*12012-08-13 07:08

13 楼

LZ pls try long hairpin RNA (lhRNA)
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
its pp130 left column
Functional screening using lhRNA expression libraries also appears to
be more efficient than using shRNA expression libraries for these
organisms.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114

【在 E*****s 的大作中提到】