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请问做质谱的牛人

请问做质谱的牛人# Biology - 生物学

C*42012-11-21 08:11

1 楼

我要同时比较3个IP的样品的差异。IP条件比较脏，大概有几百个蛋白。
我觉得用SILAC好，但是合作质谱的人坚持说label free quantitative MS更好。他说
今天的质谱已经可以定量了，只要看看峰就可以了。
我不懂质谱，请问是这样吗？
谢谢

l*y2012-11-21 08:11

2 楼

It depends on the expertise and pipeline of the particular lab.
some are good at silac, others are good at label free.
just take his advice if he is the one who will run the sample for you.

【在 C********4 的大作中提到】

: 我要同时比较3个IP的样品的差异。IP条件比较脏，大概有几百个蛋白。
: 我觉得用SILAC好，但是合作质谱的人坚持说label free quantitative MS更好。他说
: 今天的质谱已经可以定量了，只要看看峰就可以了。
: 我不懂质谱，请问是这样吗？
: 谢谢

k*02012-11-21 08:11

3 楼

我不赞成label free quantitative MS定量准的说法。

S*s2012-11-21 08:11

4 楼

基本上不做label的话，只能看个大概。
还是SILAC吧。

【在 C********4 的大作中提到】

K*S2012-11-21 08:11

5 楼

2nd this, it's more like which one is more comfortable for that mass
spectrometrist. For label free, as long as you are not looking for subtle
changes, it works pretty well nowadays.
And do you need to pay for the service? SILAC will cost a lot more in cell
culture, which usually you will do in your own lab then you mix the samples.
For label free you will have to run each sample separately. A WS guess is
that facility wants to make more revenue by recommending label free. hehe,
but this is just a WS guess.

【在 l****y 的大作中提到】

: It depends on the expertise and pipeline of the particular lab.
: some are good at silac, others are good at label free.
: just take his advice if he is the one who will run the sample for you.

C*42012-11-21 08:11

6 楼

钱不是问题，有合作的，不用付钱
SILAC标记的细胞\蛋白我都准备好了
可是合作者坚持说lable free也能定量
我也想看到敏感变化的，比如IP1样品有A蛋白1.2份，IP2有4.8份，然后我就可以说，
在IP2里面富集了4倍的A蛋白。
既然合作者说lable free也能做到。我听他的好了
不过能否解释下，以前不是说质谱不能定量，必需lable吗，现在怎么又能定量了？我
查了些资料，可是太笨了，看不大懂，能否用通俗的话解释一下。
非常谢谢

samples.

【在 K******S 的大作中提到】

: 2nd this, it's more like which one is more comfortable for that mass
: spectrometrist. For label free, as long as you are not looking for subtle
: changes, it works pretty well nowadays.
: And do you need to pay for the service? SILAC will cost a lot more in cell
: culture, which usually you will do in your own lab then you mix the samples.
: For label free you will have to run each sample separately. A WS guess is
: that facility wants to make more revenue by recommending label free. hehe,
: but this is just a WS guess.

i*g2012-11-21 08:11

7 楼

这些实验本身就有统计波动
如果你要找20%的差异，几乎不可能靠他的label free quantitative MS定量，差异100
% 多半能看出来
SILAC最好

C*42012-11-21 08:11

8 楼

请问你说的差异100%是什么意思？有和无的差异吗？
比如，我上面举的例子，1.2 VS 4.8这样的差异，4倍的变化，lable free能看出来吗
合作者真烦啊，我都准备好SILAC标记的蛋白了，他又说不让SLAC。。又不能不听他的
吧，不然他会不高兴，觉得没尊重他

100

【在 i*****g 的大作中提到】

: 这些实验本身就有统计波动
: 如果你要找20%的差异，几乎不可能靠他的label free quantitative MS定量，差异100
: % 多半能看出来
: SILAC最好

j*x2012-11-21 08:11

9 楼

毋庸置疑，眼下lable free定量的准确性还不及SILAC，但是更“fanncy”，总体而言
lable free是趋势吧。
我们这里正和Matthias Mann组合作，他们的建议是，对于four fold以上的差异，
lable free方法处理起来已经毫无压力了，所以对于Interaction Proteomics的大部分
应用而言，非常robust，不过bioinformatics上的处理要相对复杂一些。另一个就是对
质谱的分辨率有极高的要求，这个自然是前提了。

【在 C********4 的大作中提到】

: 请问你说的差异100%是什么意思？有和无的差异吗？
: 比如，我上面举的例子，1.2 VS 4.8这样的差异，4倍的变化，lable free能看出来吗
: 合作者真烦啊，我都准备好SILAC标记的蛋白了，他又说不让SLAC。。又不能不听他的
: 吧，不然他会不高兴，觉得没尊重他
:
: 100

C*42012-11-21 08:11

10 楼

原来lable free是更先进的技术啊那我就lable free好了合作者说他们的质谱仪是
最先进的一种。。
上周Matthias Mann那做过postdoc的一个PI来给talk，用的还全都是SILAC呢。。
4倍差异，lable free已经能看到了啊；那最少能看到多少差异？是不是lable free检
测到的蛋白更多呢？

【在 j****x 的大作中提到】

: 毋庸置疑，眼下lable free定量的准确性还不及SILAC，但是更“fanncy”，总体而言
: lable free是趋势吧。
: 我们这里正和Matthias Mann组合作，他们的建议是，对于four fold以上的差异，
: lable free方法处理起来已经毫无压力了，所以对于Interaction Proteomics的大部分
: 应用而言，非常robust，不过bioinformatics上的处理要相对复杂一些。另一个就是对
: 质谱的分辨率有极高的要求，这个自然是前提了。

C*42012-11-21 08:11

11 楼

能不能再说说为什么以前的质谱难以定量？
现在的为什么能定量？

【在 j****x 的大作中提到】

l*y2012-11-21 08:11

12 楼

"not quantitative" means:
1. different peptides have different ionization efficiency. Can't be
compared directly.
2. MALDI. Matrix crystallization is still unpredictable.
3. In old days, spray and homebuilt MS were not stable enough.
if you have silac samples, you should have them analyzed.
push for it after the label free results come out, since there will likely
be some proteins borderline and you want to look at them once again.
tri-state silac has complicated spectra and overlaps among peaks. It is not
theoretically better than label-free. on the other hand, label-free is quite
demanding in terms of instrument and sample handling. Fewer labs can do it
correctly.

【在 C********4 的大作中提到】

: 钱不是问题，有合作的，不用付钱
: SILAC标记的细胞\蛋白我都准备好了
: 可是合作者坚持说lable free也能定量
: 我也想看到敏感变化的，比如IP1样品有A蛋白1.2份，IP2有4.8份，然后我就可以说，
: 在IP2里面富集了4倍的A蛋白。
: 既然合作者说lable free也能做到。我听他的好了
: 不过能否解释下，以前不是说质谱不能定量，必需lable吗，现在怎么又能定量了？我
: 查了些资料，可是太笨了，看不大懂，能否用通俗的话解释一下。
: 非常谢谢
:

K*S2012-11-21 08:11

13 楼

4倍的变化用LabelFree没有问题，我说的Subtle变化是指50%以下。
关于Ms定量的问题，不同的Peptide是不能比较的，因为序列不同会造成离子化的不同
，但是同样的Peptide在不同样品里是可以比较的。
现在Label Free有2个大的方向，1是Spectral Counting （MS2 Based），2是MS1
Based的那HPLC的峰面积来定量，我个人倾向于第2种，因为更准确。一般的HPLC定量用
Uv做Detector，LCMSMS只不过是用Ms做Detector。
当然这些都基于最近的仪器发展，现在Lc和Ms都是High Resolution了，所以一般的
Label Free没有问题。

【在 C********4 的大作中提到】

b*g2012-11-21 08:11

14 楼

MS2 based quantitation 也是 EIC peak integration，不是spectral count
MS2 的好处就是remove background from other ions，就是QQQ的原理
现在MS accuracy 越来越高，如果是TOF的话，scan速度也在加快，
定量的performance跟QQQ越来越接近（当然现阶段QQQ还是有优势的）
以后的趋势绝对是 qual/quant 一个workflow

【在 K******S 的大作中提到】

: 4倍的变化用LabelFree没有问题，我说的Subtle变化是指50%以下。
: 关于Ms定量的问题，不同的Peptide是不能比较的，因为序列不同会造成离子化的不同
: ，但是同样的Peptide在不同样品里是可以比较的。
: 现在Label Free有2个大的方向，1是Spectral Counting （MS2 Based），2是MS1
: Based的那HPLC的峰面积来定量，我个人倾向于第2种，因为更准确。一般的HPLC定量用
: Uv做Detector，LCMSMS只不过是用Ms做Detector。
: 当然这些都基于最近的仪器发展，现在Lc和Ms都是High Resolution了，所以一般的
: Label Free没有问题。

K*S2012-11-21 08:11

15 楼

你和我说的不是一回事，MRM还是用Lc的Peak Area，但是有Transitions，其他的Ms1
Based定量也一般有MS2，要不怎么知道定量的什么东西呢？
但现在你即有Ms1也有Ms2，有的人就用Ms2的Spectral Count定量，有的人还回到Ms1，
用Peak Area定量。

【在 b*******g 的大作中提到】

: MS2 based quantitation 也是 EIC peak integration，不是spectral count
: MS2 的好处就是remove background from other ions，就是QQQ的原理
: 现在MS accuracy 越来越高，如果是TOF的话，scan速度也在加快，
: 定量的performance跟QQQ越来越接近（当然现阶段QQQ还是有优势的）
: 以后的趋势绝对是 qual/quant 一个workflow

j*x2012-11-21 08:11

16 楼

想问问哪一种可以说是趋势所在呢，还是说两种方法其实是可以结合起来的？考虑未来
MS技术的进一步发展

【在 K******S 的大作中提到】

: 你和我说的不是一回事，MRM还是用Lc的Peak Area，但是有Transitions，其他的Ms1
: Based定量也一般有MS2，要不怎么知道定量的什么东西呢？
: 但现在你即有Ms1也有Ms2，有的人就用Ms2的Spectral Count定量，有的人还回到Ms1，
: 用Peak Area定量。

l*y2012-11-21 08:11

17 楼

我觉得趋势就是上面有人说的，同一个run里，既做MS1，也做MS2；然后用MS2里几个
比较干净的fragment 的 XIC 来定量. 这要求每个peptide被MS2次数足够多，这样XIC
才有足够多的点来define一个峰。
现在机器比较慢，为了让更多不同的peptide被MS2, 人为的用dynamic exclusion减少
同一个peptide被重复MS2的次数；但也造成没法用fragment 的XIC来定量。
所以未来速度比较快的tof仪器应该会重新流行。

【在 j****x 的大作中提到】

: 想问问哪一种可以说是趋势所在呢，还是说两种方法其实是可以结合起来的？考虑未来
: MS技术的进一步发展

b*g2012-11-21 08:11

18 楼

Yes， you got the point
so I think fast scan TOF 会更加的popular

XIC

【在 l****y 的大作中提到】

: 我觉得趋势就是上面有人说的，同一个run里，既做MS1，也做MS2；然后用MS2里几个
: 比较干净的fragment 的 XIC 来定量. 这要求每个peptide被MS2次数足够多，这样XIC
: 才有足够多的点来define一个峰。
: 现在机器比较慢，为了让更多不同的peptide被MS2, 人为的用dynamic exclusion减少
: 同一个peptide被重复MS2的次数；但也造成没法用fragment 的XIC来定量。
: 所以未来速度比较快的tof仪器应该会重新流行。

b*g2012-11-21 08:11

19 楼

我知道你说的意思
我说的是现在or未来的方法就是把 MRM的transition 直接整合到QTOF里面去，因为
TOFscan的速度越来越快，不再需要MRM那样只scan 一个或两个fragment ion，而是直
接在 MS2里面选择一两个fragment ion。用MS2的某些 ion的 peak area 来定量，同
时MS2也提供了sequence的信息
另外你说的MS1的信息给我另外一个灵感，哈哈，谢谢。。。。

Ms1

【在 K******S 的大作中提到】

K*S2012-11-21 08:11

20 楼

现在Thermo的Q-EXACTIVE就很好，

【在 b*******g 的大作中提到】

: 我知道你说的意思
: 我说的是现在or未来的方法就是把 MRM的transition 直接整合到QTOF里面去，因为
: TOFscan的速度越来越快，不再需要MRM那样只scan 一个或两个fragment ion，而是直
: 接在 MS2里面选择一两个fragment ion。用MS2的某些 ion的 peak area 来定量，同
: 时MS2也提供了sequence的信息
: 另外你说的MS1的信息给我另外一个灵感，哈哈，谢谢。。。。
:
: Ms1

b*g2012-11-21 08:11

21 楼

我对 Q-exactive 一直有疑虑，
一旦扫描速度上去了，resolution 就跟TOF 差不多了
综合扫描速度跟resolution，顶级的QTOF还是比Q-exactive好些
但是Q-exactive 还是比顶级QTOF便宜些，另外Q-exactive可调分辨率，这样用起来比
较灵活一些

【在 K******S 的大作中提到】

: 现在Thermo的Q-EXACTIVE就很好，

K*S2012-11-21 08:11

22 楼

便宜一半啊

【在 b*******g 的大作中提到】

: 我对 Q-exactive 一直有疑虑，
: 一旦扫描速度上去了，resolution 就跟TOF 差不多了
: 综合扫描速度跟resolution，顶级的QTOF还是比Q-exactive好些
: 但是Q-exactive 还是比顶级QTOF便宜些，另外Q-exactive可调分辨率，这样用起来比
: 较灵活一些

b*g2012-11-21 08:11

23 楼

这么便宜。。。。我一直以为只便宜20-30%
心动了，赶紧找Thermo quote 一下

【在 K******S 的大作中提到】

: 便宜一半啊

s*a2012-11-21 08:11

24 楼

Q-executive, QQQ, QTOF 分别大概多少钱？
先谢了。

K*S2012-11-21 08:11

25 楼

Q-Exative是Thermo的，基本上30大几万就能拿下，因为Thermo很聪明，定的价钱正好
是Share Instrument Grant的价位，Triple Quad很多公司都有，一般的30-40万就能拿
下，QTOF贵的可能要70-80万，现在Agilent比较好划价，因为他们想抢占一些市场。

【在 s******a 的大作中提到】

: Q-executive, QQQ, QTOF 分别大概多少钱？
: 先谢了。

b*g2012-11-21 08:11

26 楼

QTOF 价格也在降
AB tripleTOF5600 跟Agilent 6550 现在都是550K左右
如果上nanosource可能在600K左右。
刚开始确实卖到750K，太黑了。

【在 K******S 的大作中提到】

: Q-Exative是Thermo的，基本上30大几万就能拿下，因为Thermo很聪明，定的价钱正好
: 是Share Instrument Grant的价位，Triple Quad很多公司都有，一般的30-40万就能拿
: 下，QTOF贵的可能要70-80万，现在Agilent比较好划价，因为他们想抢占一些市场。

K*S2012-11-21 08:11

27 楼

Waters的High End还是挺贵的吧？

【在 b*******g 的大作中提到】

: QTOF 价格也在降
: AB tripleTOF5600 跟Agilent 6550 现在都是550K左右
: 如果上nanosource可能在600K左右。
: 刚开始确实卖到750K，太黑了。

b*g2012-11-21 08:11

28 楼

标价750k, 其实7折可以买到，sales跟我说的。但是我个人不喜欢waters的仪器

【在 K******S 的大作中提到】

: Waters的High End还是挺贵的吧？

C*42012-11-21 08:11

29 楼

这么多品牌啊。。
能做定量lable free 质谱的机器，通用名是什么？ ion trap什么的？

s*a2012-11-21 08:11

30 楼

Thanks to and KingofMS and blueswing.
维护上那种机器省心一些？
我们用过FTICR 和 Orbitrap。 FTICR老出问题，维护上麻烦的多。

b*g2012-11-21 08:11

31 楼

Orbitrap 的维护比FTICR 简单很多，因为Orbitrap不用液氦跟液氮，就跟普通的MS一
样维护
其他仪器的reliability跟厂家有关，但是orbitratp只有thermo有，没得选择
仪器的reliability 也是仪器dependent
一般来说新仪器刚出来bug 多多，等几年bug fix了的话，会比较稳定。但是更新的仪
器就出来了，performance就跟不上了。

【在 s******a 的大作中提到】

: Thanks to and KingofMS and blueswing.
: 维护上那种机器省心一些？
: 我们用过FTICR 和 Orbitrap。 FTICR老出问题，维护上麻烦的多。

K*S2012-11-21 08:11

32 楼

FTICR是需要很多Attention，不过Alan marshall好像说过生产的FTICR比能熟练的造作
FTICR的人多，所以应该就业不错，不知道是否属实
其他的就Case By Case了，我上学的时候用Thermo的比较多，基本上24小时连轴转，平
均一年出一次问题，ABSciex的那个QTOF天天需要Attention。
其实Ms一般都很Robust，很多时候就算坏了自己也修不了，因为里面就是一堆的Boards
。坏了就换。反而倒是HPLC需要不停地Trouble Shooting和维护

【在 s******a 的大作中提到】

: Thanks to and KingofMS and blueswing.
: 维护上那种机器省心一些？
: 我们用过FTICR 和 Orbitrap。 FTICR老出问题，维护上麻烦的多。

s*a2012-11-21 08:11

33 楼

再次谢谢两位(including blueswing)。
您的头像实在是办公室不宜，呵呵。

Boards

【在 K******S 的大作中提到】

: FTICR是需要很多Attention，不过Alan marshall好像说过生产的FTICR比能熟练的造作
: FTICR的人多，所以应该就业不错，不知道是否属实
: 其他的就Case By Case了，我上学的时候用Thermo的比较多，基本上24小时连轴转，平
: 均一年出一次问题，ABSciex的那个QTOF天天需要Attention。
: 其实Ms一般都很Robust，很多时候就算坏了自己也修不了，因为里面就是一堆的Boards
: 。坏了就换。反而倒是HPLC需要不停地Trouble Shooting和维护

b*g2012-11-21 08:11

34 楼

哈哈，我们这里 AB TripleTOF 正常工作时间跟down机时间是 50/50
我们这个区那个工程师忙死了。。。。
所以我的实验室一定要买一台Agilent QTOF，跟一个AB 的tripleTOF
TripleTOF坏了至少可以用Agilent的做点事情

Boards

【在 K******S 的大作中提到】

K*S2012-11-21 08:11

35 楼

ha, so glad I'm not the only one who had bad experience with ABSciex TOF

【在 b*******g 的大作中提到】

: 哈哈，我们这里 AB TripleTOF 正常工作时间跟down机时间是 50/50
: 我们这个区那个工程师忙死了。。。。
: 所以我的实验室一定要买一台Agilent QTOF，跟一个AB 的tripleTOF
: TripleTOF坏了至少可以用Agilent的做点事情
:
: Boards

g*52012-11-21 08:11

36 楼

label free means send the IP samples to them directly?
thanks.I hate to cut gels.

【在 C********4 的大作中提到】

j*x2012-11-21 08:11

37 楼

Re最后一句
某种程度上讲，操作HPLC的技术含量要显著高于操作MS

Boards

【在 K******S 的大作中提到】

b*g2012-11-21 08:11

38 楼

这个就是不对了
只能说HPLC简单，一般的学生能修，但是MS复杂一般人不能修
实验室的MS坏了，如果没有service contract还是要自己修的，这样必须懂很多很多的
东西。
比如我们实验室的MALDI，从激光到turbo pump全部换过or rebuild过，重新align过光
源，这些都是有经验的technician 做的
一般人没有知识是做不了的。

【在 j****x 的大作中提到】

: Re最后一句
: 某种程度上讲，操作HPLC的技术含量要显著高于操作MS
:
: Boards

p*12012-11-21 08:11

39 楼

是的，修仪器绝对需要很多经验的，我认识的一位国内的老先生曾把BRUKER的FTICR上
的一个电路板给修好了。

【在 b*******g 的大作中提到】

: 这个就是不对了
: 只能说HPLC简单，一般的学生能修，但是MS复杂一般人不能修
: 实验室的MS坏了，如果没有service contract还是要自己修的，这样必须懂很多很多的
: 东西。
: 比如我们实验室的MALDI，从激光到turbo pump全部换过or rebuild过，重新align过光
: 源，这些都是有经验的technician 做的
: 一般人没有知识是做不了的。

l*y2012-11-21 08:11

40 楼

现在仪器都模块化了。上次thermo一个号称最牛的来修我们那个老大难的orbi, 我看
他也是一个板一个板的换。最后干脆把前面的LTQ整个换了。。。。

【在 p*****1 的大作中提到】

: 是的，修仪器绝对需要很多经验的，我认识的一位国内的老先生曾把BRUKER的FTICR上
: 的一个电路板给修好了。

S*a2012-11-21 08:11

41 楼

这不就是triple TOF 么

【在 b*******g 的大作中提到】

j*x2012-11-21 08:11

42 楼

我原文说的是操作，并不是特指维修，越复杂的构造维修越麻烦，这个道理是显而易见
的了
以我个人有限的经历，我感觉操作HPLC的trick很多，融入的个人经验化的比重很大，
尤其在纯化这一块，相比操作MS，我个人觉得某种程度上讲技术性更强。
当然我知道很可能MS技术专家并不同意我这种非专业的主观感受，太正常了

【在 b*******g 的大作中提到】

K*S2012-11-21 08:11

43 楼

以我个人有限的经历，我感觉操作HPLC的trick很多，融入的个人经验化的比重很大，
尤其在纯化这一块，相比操作MS，我个人觉得某种程度上讲技术性更强。
I think I understand your feeling. Back to my point of MS is usually more
robust than LC. For LC, the operators still need to make connections and
other hands-on stuff. While on MS, you are probably handed a tune method and
off you can go. However, if you open up the MS tune method you will find
pages and pages of settings that you can adjust.
HPLC definitely needs more hands-on work. However, with a manual, even a
graduate student can re-build the pumps without too much supervision.
I guess my whole point is that more hands-on operation doesn't necessarily
mean 技术性更强. And by no means I consider HPLC inferior to MS in our work.
It's at least equally important. A popular saying in the field "junk in,
junk out".

【在 j****x 的大作中提到】

: 我原文说的是操作，并不是特指维修，越复杂的构造维修越麻烦，这个道理是显而易见
: 的了
: 以我个人有限的经历，我感觉操作HPLC的trick很多，融入的个人经验化的比重很大，
: 尤其在纯化这一块，相比操作MS，我个人觉得某种程度上讲技术性更强。
: 当然我知道很可能MS技术专家并不同意我这种非专业的主观感受，太正常了

y*s2012-11-21 08:11

44 楼

Not considering matrix effect, current LC-MS are reproducible and linear,
owing to robustness and precision of current instrumentation
If you inject the same sample multiple times, CV should be <20% if SNR is >5
And you should easily get a straight line through standard addition
However, mass spec is not a spectroscopic detection method by nature
sample matrix greatly impacts the signals,
1 pmol/L of peptide X in 10% acetonitrile shows a signal of 100, but the
same level of peptide in a plasma digestion may only show a signal of 10
The gold standard is always using stable isotope labeled peptides/proteins
as internal standards. But label free can give you semi-quantitative
measurements if all samples have highly similar matrices.

【在 C********4 的大作中提到】