liver KO失败，跪求建议 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

liver KO失败，跪求建议

liver KO失败，跪求建议# Biology - 生物学

B*y2013-04-25 07:04

1 楼

回国过节，也许就是冥冥中手机要出点问题，下个月手机就要过保了，还出点问题
，也算是对的起我，没有在过保之后出问题。HOME键不知道怎么就按不下去了，我也是
够无奈的。在官网上约好直接就去苹果店售后了，我以为能给我换一个全新的手机。朋
友的手机也是这个键坏了，就给换了一个全新的机器。没有想到我到了之后，苹果店的
工作人员态度还是挺好的，我说是给我换一个新的手机吗？人家直接说不是，只能给换
个翻新的。我说我朋友的也是HOME键坏了，就给她换了一个新手机啊，我的怎么就不可
以。工作人员说，你朋友的手机是国行吧？我说是啊。人家直接就说你手机是在美版的
吧，只要不是国行的手机还在保修期之内的都只能换翻新机。我当时气的啊，为什么只
能给我换翻新机啊。就为了这个事情我和那个工作人员争论了很久，我就是不明白，为
什么会有这样的区别待遇？我身边也有一个从香港买的手机，也是只能换翻新的手机。
明明都是苹果的商品，我记得是可以全球联保的啊，每个地方的政策都不一样，难道是
有地方政策保护？可在我看来这样的政策有点坑爹啊。我还是要回美国的，只要是坚持
到回去的日子就可以在美国换一个全新的手机，可那些只是让朋友帮忙代购的，难道要
跑到当时买手机的所在地再换一个吗？真是讨厌这种感觉。

R*n2013-04-25 07:04

2 楼

花了几个月用albumin-CRE的老鼠做了一个KO鼠，结果realtime发现肝脏floxed基因表
达完全没变，为啥原因啊。。。

s*x2013-04-25 07:04

3 楼

楼主节哀吧，美国也是翻新机，除非你人品爆棚，翻新机缺货

D*a2013-04-25 07:04

4 楼

基因表达一般都不变吧，或者还会补偿提高。但是蛋白翻译不出来啊

g*92013-04-25 07:04

5 楼

楼主烧高香吧，国内还肯给你换。
全球联保不包括中国，给你换就不错了。
另，代购的手机，的确只能到美国换!

L*s2013-04-25 07:04

6 楼

猜测一下，你敲的基因可能还在其它肝脏细胞中表达，如fibroblast,macrophage,
stellate cells...Albumin-Cre is only expressed in hepatocytes.

【在 R******n 的大作中提到】

: 花了几个月用albumin-CRE的老鼠做了一个KO鼠，结果realtime发现肝脏floxed基因表
: 达完全没变，为啥原因啊。。。

a92013-04-25 07:04

7 楼

至少因为人家没有你这个版本的新机啊。

【在 B**********y 的大作中提到】

: 回国过节，也许就是冥冥中手机要出点问题，下个月手机就要过保了，还出点问题
: ，也算是对的起我，没有在过保之后出问题。HOME键不知道怎么就按不下去了，我也是
: 够无奈的。在官网上约好直接就去苹果店售后了，我以为能给我换一个全新的手机。朋
: 友的手机也是这个键坏了，就给换了一个全新的机器。没有想到我到了之后，苹果店的
: 工作人员态度还是挺好的，我说是给我换一个新的手机吗？人家直接说不是，只能给换
: 个翻新的。我说我朋友的也是HOME键坏了，就给她换了一个新手机啊，我的怎么就不可
: 以。工作人员说，你朋友的手机是国行吧？我说是啊。人家直接就说你手机是在美版的
: 吧，只要不是国行的手机还在保修期之内的都只能换翻新机。我当时气的啊，为什么只
: 能给我换翻新机啊。就为了这个事情我和那个工作人员争论了很久，我就是不明白，为
: 什么会有这样的区别待遇？我身边也有一个从香港买的手机，也是只能换翻新的手机。

S*92013-04-25 07:04

8 楼

分原代細胞看看。
再者，你這個KO是non inducible還是inducible的Cre？

【在 R******n 的大作中提到】

: 花了几个月用albumin-CRE的老鼠做了一个KO鼠，结果realtime发现肝脏floxed基因表
: 达完全没变，为啥原因啊。。。

f*o2013-04-25 07:04

9 楼

楼主和新闻报道的在飞机上打架那些货色成色很相近啊

D*r2013-04-25 07:04

10 楼

real time没有变化，不能说明基因没被敲除。
也许有不完整的transcript,而你设计的引物pcr产物刚好完全包括在这个transcript里
，real time 没变化完全是有可能的。
建议1重新设计引物，一边引物在你敲掉的exon上
2 如果抗体available的话,做 wb 或 IHC
3 如果基因功能确定会影响某条信号通路的话，check该通路。

j*r2013-04-25 07:04

11 楼

尼玛机器人还用手机么？

【在 B**********y 的大作中提到】

Z*g2013-04-25 07:04

12 楼

Re

【在 D*******r 的大作中提到】

: real time没有变化，不能说明基因没被敲除。
: 也许有不完整的transcript,而你设计的引物pcr产物刚好完全包括在这个transcript里
: ，real time 没变化完全是有可能的。
: 建议1重新设计引物，一边引物在你敲掉的exon上
: 2 如果抗体available的话,做 wb 或 IHC
: 3 如果基因功能确定会影响某条信号通路的话，check该通路。

j*o2013-04-25 07:04

13 楼

为什么没人提最简单的genomic DNA genotyping呢，至少PCR能看到loxp被切掉之后对
应大小的条带吧

R*n2013-04-25 07:04

14 楼

今天看了realtime primer的序列，确定在floxed位点以内，然后做了个western看到
cre在肝脏里面表达了，而且提了DNA做了个genotyping看到被切掉的带，好像cre是
work的。。。正在做western检测蛋白表达。但还是没办法解释为啥realtime做不出来
。。。很奇怪，那对引物用了n久了，做sirna过表达都能做出来没问题。。。

D*a2013-04-25 07:04

15 楼

不理解看KO为啥要做realtime...

R*n2013-04-25 07:04

16 楼

realtime不是最简单的方法么。。。

C*S2013-04-25 07:04

17 楼

肝脏里肝细胞以外的其他细胞多了去了。

【在 R******n 的大作中提到】

: realtime不是最简单的方法么。。。

R*n2013-04-25 07:04

18 楼

实质细胞还是最大的细胞群，敲除了至少对realtime结果会有影响吧。

【在 C**S 的大作中提到】

: 肝脏里肝细胞以外的其他细胞多了去了。

C*S2013-04-25 07:04

19 楼

不知道你的基因是不是实质细胞特异性表达的，在其他细胞不表达或很低？

h*n2013-04-25 07:04

20 楼

genomic DNA end point PCR

a*82013-04-25 07:04

21 楼

有很多东西待trouble shooting
大家提了很多，你可能还要确认你的Cre expressing strain是work的

j*o2013-04-25 07:04

22 楼

那就是cre效率问题，没有人能保证100%切除，况且还有其他细胞类型干扰，可以根据
genotyping被切掉的带和没被切掉的带的比例估计一下效率。这种情况western也不靠
谱，上免疫荧光，和肝细胞marker共染，看看有多少细胞被KO了。
对了，你确定你的老鼠尾巴上是flox/flox吧？

【在 R******n 的大作中提到】

: 今天看了realtime primer的序列，确定在floxed位点以内，然后做了个western看到
: cre在肝脏里面表达了，而且提了DNA做了个genotyping看到被切掉的带，好像cre是
: work的。。。正在做western检测蛋白表达。但还是没办法解释为啥realtime做不出来
: 。。。很奇怪，那对引物用了n久了，做sirna过表达都能做出来没问题。。。

l*12013-04-25 07:04

23 楼

Biology版 - 怎么检测Cre KO的效率/比例
htscorpion
2011-03-26 18:16:36
来自: 69.250.
1我有个Cre-induced tissue specific KO mouse model.
在mammary gland里, 有些细胞会表达Cre, 可能是epithelial cell. 有什么比较方便
的办法可以知道有多少细胞表达了Cre然后完成KO?
IHC for Cre and the KO gene?
or in situ hybridization for the KO gene?
谢谢.
－－－－－
chugol
2011-03-26 23:14:05
来自: 75.64.
9real-time PCR, calculate the combined / uncombined loxP, then you get the
ratio.
http://ipv6.weiming.info/zhuti/Biology/31495849/

【在 D*a 的大作中提到】

: 不理解看KO为啥要做realtime...

l*12013-04-25 07:04

24 楼

pls refer
PMID 23104561
Conditional knockout of the Slc5a6 gene in mouse intestine impairs biotin
absorption. (2013).
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304:G64-71.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23104561
or
//www.jsir.gr.jp/past_journal/3006/0536-0541.pdf

【在 R******n 的大作中提到】

: 实质细胞还是最大的细胞群，敲除了至少对realtime结果会有影响吧。

l*12013-04-25 07:04

25 楼

pls try Multiplex PCR by A, B and C three primers set (below figure that
X, Y, Z as A, B, C primers)
PMID 19936220
Generation and characterization of mice carrying a conditional allele of the
Wwox tumor suppressor gene. (2009).
PLoS One. 4: e7775.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19936220
or refer
Biology版 - 有没有可能出现假KNOCKOUT的情况?
hashuoy
2010-09-09 13:52:31
来自: 192.168.
1从公司订制的KO老鼠,带CRE基因,大半年折腾下来去掉CRE并拿到大量杂合子,按照公司
给的DATA SHEET, GENOTYPING双引物鉴定老鼠各基因表型正常,符合孟德尔遗传,但在对
培养的野生型和纯合子MEF细胞鉴定时,我发现虽然公司给的GENOTYPING鉴定没问题,但
我用RT-PCR和WB鉴定KO纯合子细胞时却都能发现该基因蛋白表达(重复多次),所以现在
感到非常困惑,我鉴定做WB的抗体是找公司制备的,非特异条带虽然有点多,但目的大小
附近有条带,而REAL-TIME PCR我之前一直用来鉴定SIRNA的KNOCKDOWN,效果也非常好,难
道是出现了假KO的情况?
－－－－
Dua
2010-09-09 17:35:41
来自: 195.83.
还有要看你们当时是怎么决定的KO的strategy吧
像我们的老鼠敲掉的是跨膜蛋白的ligand结合位点的exon，然后敲掉之后在下一个exon
中造成移码突变，然后造成几个stop，这样就确保蛋白质没有作用。
还有我们的引物设计是这样的
引物a －－loxp－exon－－引物b－－loxp－－反向引物c
这样wt和lox是靠bc来区别，ac相比之下太长扩增效率很低，ko之后就是ac扩增，这样
wt lox excised都可以用这三个引物来区分。我觉得这种pcr比你的好些，要不你自己
重新设计引物试试吧。
http://www.weiming.info/zhuti/Biology/31408513/

【在 R******n 的大作中提到】

: realtime不是最简单的方法么。。。

R*n2013-04-25 07:04

26 楼

折腾了一整天，用了可以想到的任何方法去check，最后用DNase处理了RNA重新反转录
，用同样的primer就可以作出90%的敲除效果了，应该是用Trizol提的RNA混了基因组
DNA污染造成信号干扰，虚惊一场，感谢楼上各位的帮忙，多谢多谢。

a*a2013-04-25 07:04

27 楼

永远用dnase处理一下
kit不贵的
还有一个小建议, 如果能直接染色或者wb就不要用realtime来验证了.
首先不是最终数据, 其次realtime不是决定性数据
如果要在mRNA水平检测ko, 最好的方法是在loxp两端远一点的地方设计引物PCR测序.
有时会碰到alternative splicing多切掉一个exon蛋白自动in frame的囧事...

【在 R******n 的大作中提到】

: 折腾了一整天，用了可以想到的任何方法去check，最后用DNase处理了RNA重新反转录
: ，用同样的primer就可以作出90%的敲除效果了，应该是用Trizol提的RNA混了基因组
: DNA污染造成信号干扰，虚惊一场，感谢楼上各位的帮忙，多谢多谢。