r*e
2 楼
史上最杯具的越狱
e*r
3 楼
背景是：
1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
过全长的结构。
2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
变后，解除了其对酶活性的抑制
。
4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
中更靠近，从而提高了酶活性。
5.实验过程中必须用全长蛋白，也就是说得用liposome这一类的东西。截短蛋白木有活
性，也不能结合ligand.....
问题是：在结构生物学不可能实行的情况下，只能用遗传或生化的方法，咋去证明或否
定上面这个model呢？
谢谢！
1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
过全长的结构。
2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
变后，解除了其对酶活性的抑制
。
4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
中更靠近，从而提高了酶活性。
5.实验过程中必须用全长蛋白，也就是说得用liposome这一类的东西。截短蛋白木有活
性，也不能结合ligand.....
问题是：在结构生物学不可能实行的情况下，只能用遗传或生化的方法，咋去证明或否
定上面这个model呢？
谢谢！
S*I
4 楼
连起来
【在 r*******y 的大作中提到】
: 还是像那上面一样，后两位和前9位有空格呢？多谢
【在 r*******y 的大作中提到】
: 还是像那上面一样，后两位和前9位有空格呢？多谢
c*7
5 楼
会被臭死吗？
s*c
6 楼
首先，不要说晶体结构不可能~
然后，很多方法，如果想知道dimer对活性的影响，不知道你这个蛋白多大，如果5次跨
膜以上12次跨膜以内，一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上，因为孔径的关系，
形成的基本是monomer，然后测活性。如果想定量看构象变化，最直接的方式就是
biophysics的方法，比如fluorescence based，或quenching，或fret，看构象变化，
还可以做EPR，可以看到两个residue之间距离的分布，但这些都要求site specific
labeling，需要你们能够大量表达纯化蛋白，另外也可以试cryoEM。
你们的working model基本是protein structure，protein conformational changes之
类的东西，这些想通过遗传实验的方法去证明，很难，生化也最多看看那些residues起
作用。
然后，很多方法，如果想知道dimer对活性的影响，不知道你这个蛋白多大，如果5次跨
膜以上12次跨膜以内，一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上，因为孔径的关系，
形成的基本是monomer，然后测活性。如果想定量看构象变化，最直接的方式就是
biophysics的方法，比如fluorescence based，或quenching，或fret，看构象变化，
还可以做EPR，可以看到两个residue之间距离的分布，但这些都要求site specific
labeling，需要你们能够大量表达纯化蛋白，另外也可以试cryoEM。
你们的working model基本是protein structure，protein conformational changes之
类的东西，这些想通过遗传实验的方法去证明，很难，生化也最多看看那些residues起
作用。
r*y
7 楼
thanks
【在 S**I 的大作中提到】
: 连起来
【在 S**I 的大作中提到】
: 连起来
a*r
8 楼
未必，参看Shawshank Redemption：算计好了出去又大于等着．
【在 r*********e 的大作中提到】
: 史上最杯具的越狱
【在 r*********e 的大作中提到】
: 史上最杯具的越狱
z*i
9 楼
只要有活性就好说，首先要建立以测活assay，然后用一些方法使其dimerization，测
定活性是否增加。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
定活性是否增加。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
e*e
10 楼
得到自由是无价的，萧恩克那个不也是走的下水道最后出来一身臭泥吗？真正悲剧的越
狱是有个报道说挖了很久的地道都成功了，结果偏了一点，一出来直接就是监狱看守的
值班室，哈哈。
狱是有个报道说挖了很久的地道都成功了，结果偏了一点，一出来直接就是监狱看守的
值班室，哈哈。
e*r
11 楼
谢谢啊，很多信息。结构主要是我们这种实验室也不会做。你说的其它方法我先查下文
献，消化一下......。
【在 s******c 的大作中提到】
: 首先，不要说晶体结构不可能~
: 然后，很多方法，如果想知道dimer对活性的影响，不知道你这个蛋白多大，如果5次跨
: 膜以上12次跨膜以内，一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上，因为孔径的关系，
: 形成的基本是monomer，然后测活性。如果想定量看构象变化，最直接的方式就是
: biophysics的方法，比如fluorescence based，或quenching，或fret，看构象变化，
: 还可以做EPR，可以看到两个residue之间距离的分布，但这些都要求site specific
: labeling，需要你们能够大量表达纯化蛋白，另外也可以试cryoEM。
: 你们的working model基本是protein structure，protein conformational changes之
: 类的东西，这些想通过遗传实验的方法去证明，很难，生化也最多看看那些residues起
: 作用。
献，消化一下......。
【在 s******c 的大作中提到】
: 首先，不要说晶体结构不可能~
: 然后，很多方法，如果想知道dimer对活性的影响，不知道你这个蛋白多大，如果5次跨
: 膜以上12次跨膜以内，一般可以reconstitute到HDL nanodiscs上，因为孔径的关系，
: 形成的基本是monomer，然后测活性。如果想定量看构象变化，最直接的方式就是
: biophysics的方法，比如fluorescence based，或quenching，或fret，看构象变化，
: 还可以做EPR，可以看到两个residue之间距离的分布，但这些都要求site specific
: labeling，需要你们能够大量表达纯化蛋白，另外也可以试cryoEM。
: 你们的working model基本是protein structure，protein conformational changes之
: 类的东西，这些想通过遗传实验的方法去证明，很难，生化也最多看看那些residues起
: 作用。
e*r
12 楼
嗯，把它更多地变成dimerization，值得试试。
【在 z********i 的大作中提到】
: 只要有活性就好说，首先要建立以测活assay，然后用一些方法使其dimerization，测
: 定活性是否增加。
:
: dimer
【在 z********i 的大作中提到】
: 只要有活性就好说，首先要建立以测活assay，然后用一些方法使其dimerization，测
: 定活性是否增加。
:
: dimer
e*s
13 楼
膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。
楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
的几篇文章，他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白，因为对微环境的变化非常
敏感。也可以做Quenching，但那需要有蛋白结构来设计。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
的几篇文章，他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白，因为对微环境的变化非常
敏感。也可以做Quenching，但那需要有蛋白结构来设计。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
T*e
14 楼
不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer，但是在背景中没有再提
到dimer。
我根据你的介绍，和seraphzc的回复，提出这样一种想法：
不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解，比如GRASP，大概的意思就是把荧光
蛋白拆成两个部分，然后在A神经细胞表达其中一部分，再在B神经细胞表达另一部分。
如果这两个细胞靠的够近的话，你就能看到荧光。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
在你这种情况下，可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version（1）带部分
GFP，另一个version（2）带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer，那你应该能看
到荧光。
但你的model似乎有一点复杂。虽然你的标题说是看dimer的形成有没有变化。但实际上
，我不确定你想看到有或无的dimer结合，还是你model里面更具体的“激酶活性区更靠
近”。
如果是前者的话，你可以参考我上面提到的方法。如果是后者的话，设计起来可能更复
杂。你也许要用FRET，或者这篇文章能给你灵感。
http://www.nature.com/neuro/journal/v17/n6/full/nn.3709.html
希望对你有帮助。
到dimer。
我根据你的介绍，和seraphzc的回复，提出这样一种想法：
不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解，比如GRASP，大概的意思就是把荧光
蛋白拆成两个部分，然后在A神经细胞表达其中一部分，再在B神经细胞表达另一部分。
如果这两个细胞靠的够近的话，你就能看到荧光。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
在你这种情况下，可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version（1）带部分
GFP，另一个version（2）带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer，那你应该能看
到荧光。
但你的model似乎有一点复杂。虽然你的标题说是看dimer的形成有没有变化。但实际上
，我不确定你想看到有或无的dimer结合，还是你model里面更具体的“激酶活性区更靠
近”。
如果是前者的话，你可以参考我上面提到的方法。如果是后者的话，设计起来可能更复
杂。你也许要用FRET，或者这篇文章能给你灵感。
http://www.nature.com/neuro/journal/v17/n6/full/nn.3709.html
希望对你有帮助。
s*i
15 楼
bivalent ligand?
U*t
16 楼
using bivalent ligand sounds a great idea.
e*r
17 楼
Bimane，新名词。谢谢，我去学习一下......
GPCR
【在 e****s 的大作中提到】
: 膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。
: 楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
: 的几篇文章，他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白，因为对微环境的变化非常
: 敏感。也可以做Quenching，但那需要有蛋白结构来设计。
:
: dimer
GPCR
【在 e****s 的大作中提到】
: 膜蛋白的conformational changes仍然是充满巨大挑战的课题。
: 楼上牛人回复的生物物理方法总结非常好。这方面你可以参考下Brian Kobilka在GPCR
: 的几篇文章，他用Bimane特异标记。Bimane特别适合膜蛋白，因为对微环境的变化非常
: 敏感。也可以做Quenching，但那需要有蛋白结构来设计。
:
: dimer
e*r
18 楼
唉呀，版上牛人确实不少，谢谢。我们现在还没有更多的证据，不过估计dimer应该是
已经存在了，ligand上来并不促进dimer的形成，而是使dimer内部的kinase domain靠
得近。所以您说的第二种策略可能会有效，但第一种确实也需要考虑的。
【在 T*****e 的大作中提到】
: 不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer，但是在背景中没有再提
: 到dimer。
: 我根据你的介绍，和seraphzc的回复，提出这样一种想法：
: 不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解，比如GRASP，大概的意思就是把荧光
: 蛋白拆成两个部分，然后在A神经细胞表达其中一部分，再在B神经细胞表达另一部分。
: 如果这两个细胞靠的够近的话，你就能看到荧光。
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
: 在你这种情况下，可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version（1）带部分
: GFP，另一个version（2）带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer，那你应该能看
: 到荧光。
已经存在了，ligand上来并不促进dimer的形成，而是使dimer内部的kinase domain靠
得近。所以您说的第二种策略可能会有效，但第一种确实也需要考虑的。
【在 T*****e 的大作中提到】
: 不知道我理解的对不对。楼主你标题说这个蛋白要形成dimer，但是在背景中没有再提
: 到dimer。
: 我根据你的介绍，和seraphzc的回复，提出这样一种想法：
: 不知道你对研究神经突触的一些工具有没有了解，比如GRASP，大概的意思就是把荧光
: 蛋白拆成两个部分，然后在A神经细胞表达其中一部分，再在B神经细胞表达另一部分。
: 如果这两个细胞靠的够近的话，你就能看到荧光。
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18255029
: 在你这种情况下，可以表达两个不同version的膜蛋白。其中一个version（1）带部分
: GFP，另一个version（2）带另一部分GFP。如果他们能正常形成dimer，那你应该能看
: 到荧光。
e*r
19 楼
介是啥东东？待我查查先
【在 s**i 的大作中提到】
: bivalent ligand?
【在 s**i 的大作中提到】
: bivalent ligand?
I*r
20 楼
我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer?
如果你可以提纯蛋白，那做一个gel filtration，看看活性蛋白的大小，推测是否为
dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer，分别测定它们的活性啊。
或者是我理解错了？
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
如果你可以提纯蛋白，那做一个gel filtration，看看活性蛋白的大小，推测是否为
dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer，分别测定它们的活性啊。
或者是我理解错了？
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
T*u
21 楼
膜蛋白，没法做。
【在 I*********r 的大作中提到】
: 我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer?
: 如果你可以提纯蛋白，那做一个gel filtration，看看活性蛋白的大小，推测是否为
: dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer，分别测定它们的活性啊。
: 或者是我理解错了？
:
: dimer
【在 I*********r 的大作中提到】
: 我不确定楼主的意思。你是想知道有活性蛋白是否是dimer?
: 如果你可以提纯蛋白，那做一个gel filtration，看看活性蛋白的大小，推测是否为
: dimer。如果gel filtration能同时得到dimer和monomer，分别测定它们的活性啊。
: 或者是我理解错了？
:
: dimer
T*u
22 楼
这是个结构生物学或者生物物理的问题，其他方法都很难直接证明。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
dimer
【在 e********r 的大作中提到】
: 背景是：
: 1. 这是一个细菌的膜受体激酶，结晶测三维结构是不可能的，同类蛋白从来没人搞出
: 过全长的结构。
: 2. 我们发现它能够直接bind一个ligand。受体上来后，这个激酶的活性大大上升。
: 3. 通过alanine-scanning mutagenesis，发现了一些重要的位点。其中一个氨基酸突
: 变后，解除了其对酶活性的抑制
: 。
: 4. 我们现在的working model是：ligand与receptor结合以后，通过构象变化和上述关
: 键氨基酸介导的某种机制，解除了autoinhibition，从而使这个激酸的活性区在dimer
: 中更靠近，从而提高了酶活性。
b*y
23 楼
What kinase? Histidine kinase?
c*0
24 楼
Check this one:
The ErbB4 CYT2 variant protects EGFR from ligand-induced degradation to
enhance cancer cell motility
http://stke.sciencemag.org/content/7/339/ra78.abstract
Dimerization of EGFR with an ErbB4 receptor variant increases growth factor
–induced migration of breast cancer cells
The ErbB4 CYT2 variant protects EGFR from ligand-induced degradation to
enhance cancer cell motility
http://stke.sciencemag.org/content/7/339/ra78.abstract
Dimerization of EGFR with an ErbB4 receptor variant increases growth factor
–induced migration of breast cancer cells
m*7
25 楼
你可以去试下做hydrogen deutium exchange，比较下蛋白加ligand 和没加下的
exchange rate。还可以试下light scattering，这个可以算出体系中monomer，dimer
等的量。
exchange rate。还可以试下light scattering，这个可以算出体系中monomer，dimer
等的量。
d*r
26 楼
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10707088
单分子做EGFR的，找个牛组合作，照猫画虎
单分子做EGFR的，找个牛组合作，照猫画虎
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