用methanol/chloroform抽提蛋白后怎么做western blot？？ - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

用methanol/chloroform抽提蛋白后怎么做western blot？？

用methanol/chloroform抽提蛋白后怎么做western blot？？# Biology - 生物学

m*l2015-04-22 07:04

1 楼

【以下文字转载自 Military 讨论区】
发信人: moonflower7 (teddybearmom), 信区: Military
标题: Re: Called Jimmy‘s 老板 Paul Lee, the Head of ABC.
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Oct 25 14:31:44 2013, 美东)
Ding LZ!
Future callers, please mention that their speech not only caused damage to
the Chinese community, but also promoted violence in general. It sent a very
dangerous message to the American youth that you don't have to be
responsible for what you did, and solving problems by killing people can be
an option. There is already too much violence, too much hatred, and too many
innocent teachers and students died during all the campus shooting
tragedies...

r*k2015-04-22 07:04

2 楼

这两天在extract early endosome。然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
里面的变化。我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
。然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。但是最后一步
early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
PAGE for western blot analyses.
我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后我的蛋白在哪里？而且难道抽提以后还需要
vaccum dryer把蛋白都弄成干粉然后加loading buffer煮了以后再上样？

m*l2015-04-22 07:04

3 楼

每个打电话的一个包子

very
be
many

【在 m*******l 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Military 讨论区】
: 发信人: moonflower7 (teddybearmom), 信区: Military
: 标题: Re: Called Jimmy‘s 老板 Paul Lee, the Head of ABC.
: 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Oct 25 14:31:44 2013, 美东)
: Ding LZ!
: Future callers, please mention that their speech not only caused damage to
: the Chinese community, but also promoted violence in general. It sent a very
: dangerous message to the American youth that you don't have to be
: responsible for what you did, and solving problems by killing people can be
: an option. There is already too much violence, too much hatred, and too many

a*n2015-04-22 07:04

4 楼

蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样

endosome
endosome
SDS-

【在 r******k 的大作中提到】

: 这两天在extract early endosome。然后想看看一个蛋白的磷酸化在early endosome
: 里面的变化。我用的protocol是用不同梯度浓度的sucrose去extract early endosome
: 。然后用超速离心分离。 early endosome在 25%-35%之间的液体中。但是最后一步
: early endosome was then precipitated with methanol/chloroform loaded in SDS-
: PAGE for western blot analyses.
: 我没明白methanol/CHLOROFORM抽提后我的蛋白在哪里？而且难道抽提以后还需要
: vaccum dryer把蛋白都弄成干粉然后加loading buffer煮了以后再上样？

r*k2015-04-22 07:04

5 楼

您的意思是说抽提完了以后离心吗？？？？

【在 a*****n 的大作中提到】

: 蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样
:
: endosome
: endosome
: SDS-

e*s2015-04-22 07:04

6 楼

一般的Protocol
Final Methanol 90% precipitate protein,
Spin >10000rpm fro 10 min,
Wash one time with 90% methanol,
Spin agan,
carefully decay super,
Air dry 15-30 mins,
re-suspend by SDS-buffer
我有时候把Wash那步给省略了。

【在 r******k 的大作中提到】

: 您的意思是说抽提完了以后离心吗？？？？

r*k2015-04-22 07:04

7 楼

那氯仿呢？？？
谢谢

【在 e****s 的大作中提到】

: 一般的Protocol
: Final Methanol 90% precipitate protein,
: Spin >10000rpm fro 10 min,
: Wash one time with 90% methanol,
: Spin agan,
: carefully decay super,
: Air dry 15-30 mins,
: re-suspend by SDS-buffer
: 我有时候把Wash那步给省略了。

r*k2015-04-22 07:04

8 楼

那氯仿呢？？？
谢谢

【在 e****s 的大作中提到】

a*n2015-04-22 07:04

9 楼

你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧，看样子你要么是没
有protocol要么就是还没有做过一遍，
氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊

【在 r******k 的大作中提到】

: 那氯仿呢？？？
: 谢谢

r*k2015-04-22 07:04

10 楼

我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提别的没提我也找了好久主要不知道这
比例是多少，，，

【在 a*****n 的大作中提到】

: 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧，看样子你要么是没
: 有protocol要么就是还没有做过一遍，
: 氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊

e*s2015-04-22 07:04

11 楼

我那个是一般甲醇沉蛋白的方法。
没用过氯仿。对蛋白来说，光甲醇就够了。氯仿可能是为了能有效的把蛋白从Endosome
的膜里抽出来。浓度你就自己搜吧。俺不知道。
通常甲醇用得多，是因为疏水性偏弱，只会沉蛋白，而不会衬核酸，所以处理细胞样品
很好。乙醇氯仿之类的就全下来了。

【在 r******k 的大作中提到】

: 我这protocol最后一步就是用氯仿和甲醇抽提别的没提我也找了好久主要不知道这
: 比例是多少，，，