truncated protein expression troubleshooting# Biology - 生物学
g*h
1 楼
之前自己申请niw， 140过了，现在等排气。
现在公司答应办绿卡，我可以要求办EB3吗？
现在公司答应办绿卡，我可以要求办EB3吗？
E*e
2 楼
假设内存够大，在Ubuntu 16.04上装VirtualBox+Win7
Win7里跑Microsoft Office，Adobe Acrobat和Nikon的修图软件
可行么？
Win7里跑Microsoft Office，Adobe Acrobat和Nikon的修图软件
可行么？
s*y
3 楼
今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
箱里了。
我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
箱里了。
我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
r*g
4 楼
看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
transfection）.
结果：
1. HA-Nter clone 和 HA-Cter clone 都表达了（用HA antibody，westerblot）。但
是！！！！ HA-Nter clone的蛋白（15kd supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并
且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一条非常深和clean的band。HA-Cter-clone 在
正确的
Molecular weight。
2. 唯一的可以probe 这个mitochondrial protein的 抗体，epitope在N terminus。所
以，我们用了 这个抗体，发现一模一样的结果，HA-Nter clone的蛋白（15kd
supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一
条非常深和clean的band。
3. 我们用了confocal 来看蛋白的localization， HA-Nter clone和 HA-Cter clone蛋
白 都清晰的 位于线粒体膜。
结论：
1. 蛋白表达了
2. 蛋白 在该表达的位置 表达了
3. HA-Nter-clone蛋白molecular weight 不对，recombinant protein形成aggregates
???或者其他原因？？？ 怎么解决这个问题？
因为这个原因，这个side project算是搁浅了，好久没做了...
请各位给点建议，谢谢啦！
我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
transfection）.
结果：
1. HA-Nter clone 和 HA-Cter clone 都表达了（用HA antibody，westerblot）。但
是！！！！ HA-Nter clone的蛋白（15kd supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并
且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一条非常深和clean的band。HA-Cter-clone 在
正确的
Molecular weight。
2. 唯一的可以probe 这个mitochondrial protein的 抗体，epitope在N terminus。所
以，我们用了 这个抗体，发现一模一样的结果，HA-Nter clone的蛋白（15kd
supposely），在 15kd只有一条非常模糊 并且 非常 浅的band，反而在70kd左右有一
条非常深和clean的band。
3. 我们用了confocal 来看蛋白的localization， HA-Nter clone和 HA-Cter clone蛋
白 都清晰的 位于线粒体膜。
结论：
1. 蛋白表达了
2. 蛋白 在该表达的位置 表达了
3. HA-Nter-clone蛋白molecular weight 不对，recombinant protein形成aggregates
???或者其他原因？？？ 怎么解决这个问题？
因为这个原因，这个side project算是搁浅了，好久没做了...
请各位给点建议，谢谢啦！
s*y
5 楼
当然可以，你这是最“合法”的两条队一起排，只不过EB3必须走perm，最近perm批准
周期相当长
另外，既然NIW都过了，干嘛不跟公司申请支持EB1B呢？
包子，谢谢
【在 g*******h 的大作中提到】
: 之前自己申请niw， 140过了，现在等排气。
: 现在公司答应办绿卡，我可以要求办EB3吗？
周期相当长
另外，既然NIW都过了，干嘛不跟公司申请支持EB1B呢？
包子，谢谢
【在 g*******h 的大作中提到】
: 之前自己申请niw， 140过了，现在等排气。
: 现在公司答应办绿卡，我可以要求办EB3吗？
i*l
6 楼
没问题啊
U*B
7 楼
Stupidity will be punished
i*a
8 楼
你的WB有负对照吗，就是untagged。
c*n
9 楼
好几年没用virtualbox了 不知道显卡加速做得怎么样了
如果是我就win7下面跑ubuntu
或者直接win10里面跑ubuntu
win系列的娱乐功能还是没法比的
如果是我就win7下面跑ubuntu
或者直接win10里面跑ubuntu
win系列的娱乐功能还是没法比的
w*g
10 楼
白富美么?
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
r*g
11 楼
有full length，untagged 的对照～ 也有full length, tagged的对照～ molecular
weight没有问题
我没有克隆 untagged的 N-ter truncated protein 或者 C-ter trucated protein,
另外，没有争对 C-ter truncated region的 抗体
唯一的抗体 是对Nter的epitope
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
weight没有问题
我没有克隆 untagged的 N-ter truncated protein 或者 C-ter trucated protein,
另外，没有争对 C-ter truncated region的 抗体
唯一的抗体 是对Nter的epitope
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
E*e
12 楼
Linux是主力干活机啊，编程跑计算什么的，放虚拟机不好吧？
还有娱乐具体指啥？我的娱乐基本就是Kodi。。。
【在 c******n 的大作中提到】
: 好几年没用virtualbox了 不知道显卡加速做得怎么样了
: 如果是我就win7下面跑ubuntu
: 或者直接win10里面跑ubuntu
: win系列的娱乐功能还是没法比的
还有娱乐具体指啥？我的娱乐基本就是Kodi。。。
【在 c******n 的大作中提到】
: 好几年没用virtualbox了 不知道显卡加速做得怎么样了
: 如果是我就win7下面跑ubuntu
: 或者直接win10里面跑ubuntu
: win系列的娱乐功能还是没法比的
c*l
13 楼
当verizon的店小二实在太爽了
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
l*a
14 楼
参见楼主的结果2
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
【在 i**********a 的大作中提到】
: 你的WB有负对照吗，就是untagged。
g*g
15 楼
呵呵
说不定是坏的呢
修的钱比买个新的还贵？
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
说不定是坏的呢
修的钱比买个新的还贵？
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
l*a
16 楼
HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
d*b
17 楼
rich is a life style
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
r*g
18 楼
sorry，没有讲明白
2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
promotor是 CMV
最后克隆的两个plasmids
HA-Nter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
HA-Cter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
---- IRES------EGFP
【在 l******a 的大作中提到】
: HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
:
: ter
2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
promotor是 CMV
最后克隆的两个plasmids
HA-Nter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
HA-Cter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
---- IRES------EGFP
【在 l******a 的大作中提到】
: HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
:
: ter
x*n
19 楼
你当场没donate一个？国威何在啊。。。
e*s
20 楼
Double check 你的克隆。Make sure stop code是正确的，没有产生Frame shift.
我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
再停下来。
+a
terminus-
【在 r******g 的大作中提到】
: sorry，没有讲明白
: 2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
: promotor是 CMV
: 最后克隆的两个plasmids
: HA-Nter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
: few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
: HA-Cter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
: ---- IRES------EGFP
我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
再停下来。
+a
terminus-
【在 r******g 的大作中提到】
: sorry，没有讲明白
: 2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
: promotor是 CMV
: 最后克隆的两个plasmids
: HA-Nter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
: few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
: HA-Cter
: CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
: ---- IRES------EGFP
s*y
21 楼
【在 x*********n 的大作中提到】
: 你当场没donate一个？国威何在啊。。。
r*g
22 楼
这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
没问题～
westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
然后一个很粗的 upper 70kd的band
因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
code
【在 e****s 的大作中提到】
: Double check 你的克隆。Make sure stop code是正确的，没有产生Frame shift.
: 我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
: Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
: 再停下来。
:
: +a
: terminus-
没问题～
westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
然后一个很粗的 upper 70kd的band
因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
code
【在 e****s 的大作中提到】
: Double check 你的克隆。Make sure stop code是正确的，没有产生Frame shift.
: 我觉得最可能的解释就是Frame shift，所以你的蛋白和Tag都在，但在后段可能有
: Frame shift突变，把Stop code给突变了。所以一直表达到70K，遇见另一个Stop code
: 再停下来。
:
: +a
: terminus-
s*y
23 楼
应该是work的，小二之前帮她倒里面的联系人啥的
【在 g******g 的大作中提到】
: 呵呵
: 说不定是坏的呢
: 修的钱比买个新的还贵？
:
: donate
【在 g******g 的大作中提到】
: 呵呵
: 说不定是坏的呢
: 修的钱比买个新的还贵？
:
: donate
a*n
24 楼
modification?
【在 r******g 的大作中提到】
: 这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
: 没问题～
: westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
: 然后一个很粗的 upper 70kd的band
: 因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
: band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
:
: code
【在 r******g 的大作中提到】
: 这个是 我第一个检查的～ doublecheck了很多遍
: 没问题～
: westernblot上面 很明显的，有一个 正常molecular weight的 很浅的lower band，
: 然后一个很粗的 upper 70kd的band
: 因为，有lower band，所以，也不大可能是 frameshift，不然 根本不可能有lower
: band，对不对？ （293 不表达endogenous的这个 protein）
:
: code
z*3
25 楼
美国人挣一万花一万 WSN挣一万花一千
n*y
26 楼
1. 给插入的蛋白和GFP换个位置。
2. 用PP2A。
2. 用PP2A。
t*n
27 楼
机器里面还有照片。。。
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
donate
【在 s****y 的大作中提到】
: 今天去verizon搞账户的事情，看到一白女新换了iphone5， 把旧4s就直接扔进donate
: 箱里了。
: 我当时只能默默的把手中的4代旧果子放进口袋里。
W*V
28 楼
using loading buffer containing 4M urea + 2mM 2-mercaptoethanol. If you get
right, please feedback.
right, please feedback.
t*r
29 楼
把白牛当场正法了才扬国威
【在 x*********n 的大作中提到】
: 你当场没donate一个？国威何在啊。。。
【在 x*********n 的大作中提到】
: 你当场没donate一个？国威何在啊。。。
r*g
30 楼
I will give a try first thing next week. Thanks
You mean loading for Western blot right?
get
【在 W*V 的大作中提到】
: using loading buffer containing 4M urea + 2mM 2-mercaptoethanol. If you get
: right, please feedback.
You mean loading for Western blot right?
get
【在 W*V 的大作中提到】
: using loading buffer containing 4M urea + 2mM 2-mercaptoethanol. If you get
: right, please feedback.
a*x
31 楼
A blonde?
W*V
32 楼
Right. loading samples on gel runing SDS-PAGE.
c*l
33 楼
江南style?
【在 d*b 的大作中提到】
: rich is a life style
:
: donate
【在 d*b 的大作中提到】
: rich is a life style
:
: donate
i*l
34 楼
agree with above,maybe oligomer due to non specific hydrophobic interactions
, which is not uncommon among transmembrane proteins.
4-6M urea, try to completely denature your sample,
however, if oligomer forms, sample usually runs in a ladder pattern, say,
dimer, tetramer, etc. if you only see two major bands, one monomer, the
other ~4x or 6x apparent molecular weight, it's still a little weird to me.
, which is not uncommon among transmembrane proteins.
4-6M urea, try to completely denature your sample,
however, if oligomer forms, sample usually runs in a ladder pattern, say,
dimer, tetramer, etc. if you only see two major bands, one monomer, the
other ~4x or 6x apparent molecular weight, it's still a little weird to me.
c*1
35 楼
这么有钱。。
M*g
36 楼
Try not to heat up your protein samples in SDS loading buffer. Many
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation.
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation.
r*g
37 楼
难怪黑人要革命，奥黑应该规定每个人都要有个iphone5
【在 c******1 的大作中提到】
: 这么有钱。。
【在 c******1 的大作中提到】
: 这么有钱。。
M*g
38 楼
Try not to heat up your protein samples in SDS loading buffer. Many
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation.
membrane proteins form aggregates even in SDS-loading buffer when they are
heated. 70 kd may be your protein aggregation.
r*y
39 楼
江南style
p*t
40 楼
可能抗体不特异，楼主可以把70kDa的条带切下来送质谱。
如果是oligomer，质谱也能看出来。
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
如果是oligomer，质谱也能看出来。
ter
【在 r******g 的大作中提到】
: 看到 很多大牛们出来讨论 那个克隆的问题～ 我也来征求一下大家的suggestions～
: 我们实验室 研究一个 mitochondrial protein的功能。 是一个mitochondrial
: transmembrane protein。我的实验目的 是，克隆表达 这个蛋白的 5'-HA tag-Nter
: region-Transmembrane-3' (缩写HA-Nter clone) 和 5'-HA tag-transmembrane-C-ter
: region-3' (HA-Cter clone) 两个truncated protein.
: clone挺简单，因为 克隆cDNA，并且，蛋白很小，只有200氨基酸。我克隆的片段也挺
: 小的，没有经历太多难度。我把 Nter clone 和 Cter clone 都克隆到 一个
: retroviral vector，coding region后面有一个IRES-GFP。plasmid 8.6kb。
: 接下来,我把这个HA-Nter clone 和HA-Cter clone，用293 cell 表达（CaCl2
: transfection）.
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