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求问E.coli knock out相关问题

求问E.coli knock out相关问题# Biology - 生物学

R*n2016-04-24 07:04

1 楼

想用lamda red在BL21中敲一个基因，按照protocol，把pKD46转入BL21，很奇怪的是不
管用化转还是电转，涂板后都没有长出来，但是转其他的质粒都没有问题。对pKD46跑
胶和单酶切都没有问题，按照protocol所有incubation的温度都是30度。同时还试过E.
coli 另外的菌株BW25113也是出现同样问题。有人遇到过质粒转成这样的情况吗？多谢
！

j*n2016-04-24 07:04

2 楼

怀疑plasmid有问题
好奇为啥验证用单酶切验证？就是跑个胶看下大小？和pKD46差不多大小的plasmid多了
去了
做个多酶切先看下plasmid对不对吧

E.

【在 R******n 的大作中提到】

: 想用lamda red在BL21中敲一个基因，按照protocol，把pKD46转入BL21，很奇怪的是不
: 管用化转还是电转，涂板后都没有长出来，但是转其他的质粒都没有问题。对pKD46跑
: 胶和单酶切都没有问题，按照protocol所有incubation的温度都是30度。同时还试过E.
: coli 另外的菌株BW25113也是出现同样问题。有人遇到过质粒转成这样的情况吗？多谢
: ！

H*i2016-04-24 07:04

3 楼

“试过E.coli 另外的菌株BW25113也是出现同样问题”
质粒问题呗。当然最好看看你们的培养箱的30°确认下没问题，不能确认就放室温
（25°）长，也应该能长出来。
另外多说一句，这个pKD46构建比较早了，KO效率不如一些新构建的。
还有听一些人说过BL21 用这个方法KO好像很难？不过这个我没验证过。

j*n2016-04-24 07:04

4 楼

是很难。。。不管什么方法 BL21都很难敲除
没用过最新的crispr 希望会好一点

【在 H*******i 的大作中提到】

: “试过E.coli 另外的菌株BW25113也是出现同样问题”
: 质粒问题呗。当然最好看看你们的培养箱的30°确认下没问题，不能确认就放室温
: （25°）长，也应该能长出来。
: 另外多说一句，这个pKD46构建比较早了，KO效率不如一些新构建的。
: 还有听一些人说过BL21 用这个方法KO好像很难？不过这个我没验证过。