c*6
2 楼
在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
H*g
3 楼
我以后会尽量劝说家人朋友都不要买果果的产品吧，
从劝我老婆开始。
从劝我老婆开始。
m*D
4 楼
你是说发一个method? 关键是你真要引进一个mutation的时候，你这插入的两个“带有
不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
颜色的template，会有疑问。
我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
确实比较费劲。
不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
颜色的template，会有疑问。
我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
确实比较费劲。
f*5
5 楼
it is all about police, why it is related to apple??
b*c
6 楼
H*g
7 楼
装B呀，花钱买产品还买出事来了？ 就不买了吧，个人选择么，反正果果也不缺我一个
人
人
c*6
8 楼
你们是在什么细胞系里边做的呢？
这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
有问题的。
通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
homozygous
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你是说发一个method? 关键是你真要引进一个mutation的时候，你这插入的两个“带有
: 不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
: 达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
: BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
: 颜色的template，会有疑问。
: 我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
: 的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
: 1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
: 了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
: mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
有问题的。
通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
homozygous
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你是说发一个method? 关键是你真要引进一个mutation的时候，你这插入的两个“带有
: 不同的颜色”的HDR templates（大约是表达GFP一类吧）就会影响你想改变的基因的表
: 达吧？类似的已经发表了，但只用了一个带颜色的template （GFP),你看看
: BioTechniques,57:115-124.他们拿到homozygous的概率蛮高的，有没有必要两个不同
: 颜色的template，会有疑问。
: 我最近也完成了point mutation，都是只改变一个amino acid,发现拿到的homozygous
: 的概率大约是拿到heterzygous的一半。但拿到heterzygous的概率大约是1 out of
: 1000-1500 transfected cells. 也就是homozygous的概率是大约1/2000-3000。我是用
: 了mutant的特性来筛选的，没有在HDR template插入任何东西，就是引入point
: mutation和几个不改变amino acid的突变，如restriction enzyme sites. 没有筛选，
H*g
9 楼
nothing about police. Those two officers are hired by Apple store. In other
word, they are Apple's security guard, because they were off-duty during
that incident.
【在 f***5 的大作中提到】
: it is all about police, why it is related to apple??
word, they are Apple's security guard, because they were off-duty during
that incident.
【在 f***5 的大作中提到】
: it is all about police, why it is related to apple??
c*6
10 楼
这个思路跟这两篇文章完全不一样，我所想的那个没有办法用于in vivo的提高效率，
而只是把突变成功的细胞高效的筛选出来，本身不能提高重组效率。
【在 b******c 的大作中提到】
: 有几篇和你的想法类似的文章都发的高点数期刊。支持。
: http://www.nature.com/nbt/journal/v33/n5/full/nbt.3198.html
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(15)00004
而只是把突变成功的细胞高效的筛选出来，本身不能提高重组效率。
【在 b******c 的大作中提到】
: 有几篇和你的想法类似的文章都发的高点数期刊。支持。
: http://www.nature.com/nbt/journal/v33/n5/full/nbt.3198.html
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(15)00004
m*d
11 楼
那就是果子的雇员了
other
【在 H*******g 的大作中提到】
: nothing about police. Those two officers are hired by Apple store. In other
: word, they are Apple's security guard, because they were off-duty during
: that incident.
other
【在 H*******g 的大作中提到】
: nothing about police. Those two officers are hired by Apple store. In other
: word, they are Apple's security guard, because they were off-duty during
: that incident.
m*D
12 楼
哦，我用癌细胞。
以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
H*g
13 楼
是的。所以这个事情就是果子店种族歧视中国人，然后召唤他的保安对华裔实施暴力。
【在 m*d 的大作中提到】
: 那就是果子的雇员了
:
: other
【在 m*d 的大作中提到】
: 那就是果子的雇员了
:
: other
s*y
14 楼
我怎么觉得你说的这个方法其实是得到homogzygous 的一种标准方法吧？
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
H*n
15 楼
我也是，从自己开始劝身边人不再购买果子的任何产品。
回国朋友让带果子产品，坚决不给带，要带换其他品牌的同类产品。
话说我没给自己买过任何果子的产品，iPhone还是朋友送的。
【在 H********g 的大作中提到】
: 我以后会尽量劝说家人朋友都不要买果果的产品吧，
: 从劝我老婆开始。
回国朋友让带果子产品，坚决不给带，要带换其他品牌的同类产品。
话说我没给自己买过任何果子的产品，iPhone还是朋友送的。
【在 H********g 的大作中提到】
: 我以后会尽量劝说家人朋友都不要买果果的产品吧，
: 从劝我老婆开始。
c*6
16 楼
还不是标准方法，现在大多数是只用一种荧光，然后再从带有荧光的细胞里边筛hetero
和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
就是homozygous的
【在 s******y 的大作中提到】
: 我怎么觉得你说的这个方法其实是得到homogzygous 的一种标准方法吧？
和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
就是homozygous的
【在 s******y 的大作中提到】
: 我怎么觉得你说的这个方法其实是得到homogzygous 的一种标准方法吧？
h*x
17 楼
z支持
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
c*6
18 楼
piggybac系统是可以做到完全foot-print free的
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哦，我用癌细胞。
: 以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
: 你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
:
: 变。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哦，我用癌细胞。
: 以前也想过cre/loxp，但总是有几个Nt，不敢用。
: 你多听其他同行的，我也是这个方面的新手。好运！
:
: 变。
g*n
19 楼
LD还要换新ipad，毛，不给换，上大安猪板子伺候~
s*y
20 楼
去年就有人在这个网上说过这个方法了，所以我有印象。
除非那个方法只是大家都知道的土法子而没有人发表过。
hetero
【在 c********6 的大作中提到】
: 还不是标准方法，现在大多数是只用一种荧光，然后再从带有荧光的细胞里边筛hetero
: 和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
: 就是homozygous的
除非那个方法只是大家都知道的土法子而没有人发表过。
hetero
【在 c********6 的大作中提到】
: 还不是标准方法，现在大多数是只用一种荧光，然后再从带有荧光的细胞里边筛hetero
: 和homozygous。如果我用两种荧光，那不就是一步得到，只要细胞同时带有这两种荧光
: 就是homozygous的
b*r
21 楼
看了网上（yahoo)的评论，的确有不少人半开玩笑的说，这下终于有理由不用给家人买
苹果做圣诞礼物了。
苹果做圣诞礼物了。
z*u
22 楼
不太明白这点，piggybac过表达难道不是引起transpose跳转吗？不明白为啥会把俩itr
间的序列切除掉？
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
间的序列切除掉？
变。
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们是在什么细胞系里边做的呢？
: 这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
: 签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
: 有问题的。
: 通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
: 有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
: 因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
: 细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
: ，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
: Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
p*n
23 楼
say NO to apple.
s*r
24 楼
TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
候split，看光源用了几个wavelength。
所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
好像我都是在泼冷水，抱歉。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
候split，看光源用了几个wavelength。
所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
好像我都是在泼冷水，抱歉。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
b*d
25 楼
say NO to apple.
j*i
26 楼
大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧
c*4
27 楼
say NO to apple.
c*6
28 楼
我觉得你说的非常有道理，我个人也不太看好这个。我去查找一下那个TALEN 加双色的
系统，好让我老板看看，让他冷静下来。
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
系统，好让我老板看看，让他冷静下来。
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
z*r
29 楼
say NO to apple
大家保持队形，保持队形的都有包子
【在 c******4 的大作中提到】
: say NO to apple.
大家保持队形，保持队形的都有包子
【在 c******4 的大作中提到】
: say NO to apple.
c*6
30 楼
在人的干细胞里边，除非你使用那个ssODN，这个据很多人反馈是你不筛够2000个克隆
，想都不用想成功。另外能够想到的foot-print free的编辑方法就是结合piggyBac了。
确实不太方便，文章里边报道的加个HSV-DTK，使用FIAU做阴性筛选，百分之60-70.实
际效果是，筛选70-80个克隆，有一个抗FIAU的克隆是成功去除掉了筛选标签。
【在 j******i 的大作中提到】
: 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
: piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧
，想都不用想成功。另外能够想到的foot-print free的编辑方法就是结合piggyBac了。
确实不太方便，文章里边报道的加个HSV-DTK，使用FIAU做阴性筛选，百分之60-70.实
际效果是，筛选70-80个克隆，有一个抗FIAU的克隆是成功去除掉了筛选标签。
【在 j******i 的大作中提到】
: 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
: piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧
g*g
31 楼
say NO to apple
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
c*6
32 楼
你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
【在 s******r 的大作中提到】
: TALEN用双色的思路应该是发在cell还是csc上的，那是几年前了，所以idea本身不算是
: 很innovative。你在质粒上加个蓝色做负筛选，这个不知道有没有人做过，要没有的话
: 可以试试，如果你在那几个大牛实验室可能会发的还可以，不过看你在这儿问这些估计
: 不是，所以期望别太高。流式的时候不是几个颜色就照几次的，一道光照上去，收的时
: 候split，看光源用了几个wavelength。
: 所谓干细胞基因编辑效率低其实是个伪命题，如果你的目的是建系多用点细胞就好了，
: 基本上没有拿不到的。如果你是要研究提高效率方法，那么除非新办法是改进机制的能
: 实现数量级上的提升，其他的修修补补不过是小打小闹，就是为了灌一瓢水。
: 好像我都是在泼冷水，抱歉。
k*e
33 楼
say NO to apple
z*t
34 楼
兄弟你看看这篇文章，这也是大家已经很熟悉的topic和方法，这篇文章就卖到了CSC
http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
【在 c********6 的大作中提到】
: 你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
: 使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
: 能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
【在 c********6 的大作中提到】
: 你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
: 使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
: 能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？
t*2
35 楼
joke阿
日本鬼子作恶多端
诸位还不是该买日车卖日车
该买日相机买日相机
-
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
日本鬼子作恶多端
诸位还不是该买日车卖日车
该买日相机买日相机
-
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
c*6
36 楼
多谢这篇有用的文章，但是他们是用两种带有不同的抗生素donor做模板去构建一个
iCAS细胞系。有没有那种使用两种不同荧光donor构建细胞系的文章呢
【在 z*t 的大作中提到】
: 兄弟你看看这篇文章，这也是大家已经很熟悉的topic和方法，这篇文章就卖到了CSC
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
iCAS细胞系。有没有那种使用两种不同荧光donor构建细胞系的文章呢
【在 z*t 的大作中提到】
: 兄弟你看看这篇文章，这也是大家已经很熟悉的topic和方法，这篇文章就卖到了CSC
: http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(16)00023
H*g
37 楼
这都是情绪化的东西，跟你费口舌讲道理也没有意思。
我都说了，从我做起。你自己愿意怎么样别人根本管不到。
【在 t*********2 的大作中提到】
: joke阿
: 日本鬼子作恶多端
: 诸位还不是该买日车卖日车
: 该买日相机买日相机
:
: -
我都说了，从我做起。你自己愿意怎么样别人根本管不到。
【在 t*********2 的大作中提到】
: joke阿
: 日本鬼子作恶多端
: 诸位还不是该买日车卖日车
: 该买日相机买日相机
:
: -
c*6
38 楼
这个能获诺奖吗，会被颜宁嫉妒吗，哈哈
c*4
39 楼
say NO to Japan too!!
【在 t*********2 的大作中提到】
: joke阿
: 日本鬼子作恶多端
: 诸位还不是该买日车卖日车
: 该买日相机买日相机
:
: -
【在 t*********2 的大作中提到】
: joke阿
: 日本鬼子作恶多端
: 诸位还不是该买日车卖日车
: 该买日相机买日相机
:
: -
e*6
40 楼
好好组织下，如果写的不错，投在plos one应该能发
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
: 个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
: 断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
: 就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
: 排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
: 做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
: 胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
: 线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
: 还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。
r*8
41 楼
say NO to apple
本来就不买果子的任何东西
本来就不买果子的任何东西
x*s
42 楼
Police will tease anyone who resist arrest, nothing to do with HuangNiu/
Apple
Apple
l*x
43 楼
say NO to apple
h*r
44 楼
支持
h*r
45 楼
从我做起，苹果的东西，绝不再买
c*a
46 楼
say NO to apple
r*0
47 楼
say NO to apple
r*e
48 楼
果粉们非要这种极端事件刺激一下啊。是好事，看清果子的真面目。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
B*s
49 楼
say NO to apple
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
l*n
50 楼
say No to 黄牛
c*a
51 楼
从来也没用过苹果产品， 今后也没计划购买。
可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
户群。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
户群。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
ay
52 楼
顶你
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
【在 H********g 的大作中提到】
: 从我做起吧。
: 果果这他妈都养了一堆什么样的人渣呀？
: 我真心觉得以前做错了，后悔了。。
d*3
53 楼
say NO to apple
Z*o
54 楼
say NO to apple
u*d
55 楼
发言之前，至少你也得google一下吧。
【在 c******a 的大作中提到】
: 从来也没用过苹果产品， 今后也没计划购买。
: 可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
: 这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
: 户群。
【在 c******a 的大作中提到】
: 从来也没用过苹果产品， 今后也没计划购买。
: 可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
: 这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
: 户群。
S*r
56 楼
Say NO to Apple, hehe.
c*4
57 楼
扯了吧
靠的就是中国用户
没了中国用户苹果的收入至少缩减50%+
【在 c******a 的大作中提到】
: 从来也没用过苹果产品， 今后也没计划购买。
: 可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
: 这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
: 户群。
靠的就是中国用户
没了中国用户苹果的收入至少缩减50%+
【在 c******a 的大作中提到】
: 从来也没用过苹果产品， 今后也没计划购买。
: 可问题是， 人苹果根本不缺中国这些用户。
: 这么说吧， 即便中国人突然全都消失了，对苹果的影响只是出现在生产上， 而不是用
: 户群。
l*x
58 楼
say no to apple
do it too.
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
do it too.
【在 z**r 的大作中提到】
: say NO to apple
: 大家保持队形，保持队形的都有包子
j*s
59 楼
do NO to apple
g*r
60 楼
果子是挺过分的，有你sb的那一天
f*k
61 楼
say NO to apple
c*a
62 楼
那就奇怪了, 照这么说, 苹果应该哈巴着中国客户才对.
比如,各族人等都有黄牛，都有resaler，那么，对中国黄牛就要网开一面，对吧。
可现在反过来了，又要挣你的钱， 又要区别对待你。 最可恨的是被欺负的人群还要去
使劲舔人家的屁股。 真tnd一个周瑜一个黄盖，一个S，一个M。
【在 c******4 的大作中提到】
: 扯了吧
: 靠的就是中国用户
: 没了中国用户苹果的收入至少缩减50%+
比如,各族人等都有黄牛，都有resaler，那么，对中国黄牛就要网开一面，对吧。
可现在反过来了，又要挣你的钱， 又要区别对待你。 最可恨的是被欺负的人群还要去
使劲舔人家的屁股。 真tnd一个周瑜一个黄盖，一个S，一个M。
【在 c******4 的大作中提到】
: 扯了吧
: 靠的就是中国用户
: 没了中国用户苹果的收入至少缩减50%+
s*e
63 楼
Say no to apple! Support Chinese brands
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