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抗体过Mono Q柱损失:上了2mg洗脱下来只有1mg
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抗体过Mono Q柱损失:上了2mg洗脱下来只有1mg# Biology - 生物学
d*g
1
如题,抗体过Mono Q 柱损失,上了2mg结果洗脱下来的只有1mg。从抗体上柱到洗脱下
来之前, 通过flowthrough中UV280的检测,看不到任何的蛋白不挂柱而造成的流失:
UV280一直在基线水平,和过Buffer A-20mM Tris的水平一样。 但是收集到所有洗脱下
来的抗体组分,根据测得的浓度和体积的乘积,加和所有的fractions,结果就是2mg的
上样,只得到1mg。请问是损失了1mg吗?损失的部分去哪里了呢?
同时,还有一个问题:
同一个均一样品(Protein A纯化过的抗体,透析到PBS中), 为何分两次上样(每次
3mg), 即使设置条件完全一致,结果出来的峰形会不一样呢? 怎样可以让峰形稳定
一些?
谢谢!
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f*e
2
过柱损失50%是正常范围内的,那些号称回收率90%以上的都是理想状态下,或者某些蛋
白,大部分都有损失。Q 是离子交换,一般不像亲和层析一样,能结合所有样品。
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t*m
3
比如死柱子上了

【在 d*******g 的大作中提到】
: 如题,抗体过Mono Q 柱损失,上了2mg结果洗脱下来的只有1mg。从抗体上柱到洗脱下
: 来之前, 通过flowthrough中UV280的检测,看不到任何的蛋白不挂柱而造成的流失:
: UV280一直在基线水平,和过Buffer A-20mM Tris的水平一样。 但是收集到所有洗脱下
: 来的抗体组分,根据测得的浓度和体积的乘积,加和所有的fractions,结果就是2mg的
: 上样,只得到1mg。请问是损失了1mg吗?损失的部分去哪里了呢?
: 同时,还有一个问题:
: 同一个均一样品(Protein A纯化过的抗体,透析到PBS中), 为何分两次上样(每次
: 3mg), 即使设置条件完全一致,结果出来的峰形会不一样呢? 怎样可以让峰形稳定
: 一些?
: 谢谢!

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d*g
4
谢谢!你这么一说,感觉心情好多了~

【在 f****e 的大作中提到】
: 过柱损失50%是正常范围内的,那些号称回收率90%以上的都是理想状态下,或者某些蛋
: 白,大部分都有损失。Q 是离子交换,一般不像亲和层析一样,能结合所有样品。

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d*g
5
应该不是。 我一般纯化五六次之后, 要用很严苛的洗剂方法清晰柱子(1M NaOH, 6M
盐酸胍, 70%乙醇), 结果洗不下来很多蛋白。

【在 t**m 的大作中提到】
: 比如死柱子上了
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f*e
6
不用客气

【在 d*******g 的大作中提到】
: 谢谢!你这么一说,感觉心情好多了~
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b*1
7
这个太正常了,50%已经不少了 :)

【在 d*******g 的大作中提到】
: 如题,抗体过Mono Q 柱损失,上了2mg结果洗脱下来的只有1mg。从抗体上柱到洗脱下
: 来之前, 通过flowthrough中UV280的检测,看不到任何的蛋白不挂柱而造成的流失:
: UV280一直在基线水平,和过Buffer A-20mM Tris的水平一样。 但是收集到所有洗脱下
: 来的抗体组分,根据测得的浓度和体积的乘积,加和所有的fractions,结果就是2mg的
: 上样,只得到1mg。请问是损失了1mg吗?损失的部分去哪里了呢?
: 同时,还有一个问题:
: 同一个均一样品(Protein A纯化过的抗体,透析到PBS中), 为何分两次上样(每次
: 3mg), 即使设置条件完全一致,结果出来的峰形会不一样呢? 怎样可以让峰形稳定
: 一些?
: 谢谢!

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a*e
8
太正常了 不需要担心
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d*g
9
谢谢楼上几位的信息。太安慰脆弱的心灵了。 不过话说回来,该如何提高得率呢?那
些损失的蛋白都哪里去了,没有挂到柱子上,流失了,但是对于Flowthrough的UV280的
检测,也看不到有蛋白的迹象啊?

【在 a*******e 的大作中提到】
: 太正常了 不需要担心
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