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郁闷的pfu pcr。。。。

郁闷的pfu pcr。。。。# Biology - 生物学

c*g2010-11-01 07:11

1 楼

抱歉来不及重写。请知情朋友指教。
详情见此：
https://www.flyertalk.com/forum/europe/1605378-urgent-stay-will-exceed-max-
duration.html#post23412586
多谢！

n*w2010-11-01 07:11

2 楼

用taq克隆了一段时间发现有突变，于是从stratagene买了pfu回来。。。
结果就杯具了。。。都摸了1周多条件了。。。
我要p的是cDNA，从公司买回来的vector。。。
primer1的Tm在55度，primer2的Tm在57度。。。于是我annealing temp用50度走。。。
看到instructions说amplify cDNA，要加Mg到3mM。。。
于是我就照做了，
那次很幸运，出现了条带，可是我再用同样的条件去重复，就是出不来条带。。。
唉。。。

b*n2010-11-01 07:11

3 楼

用gradient PCR去摸退火温度的条件
我经常这么干
另外如果68度扩增不出来，换成72度试试看

【在 n***w 的大作中提到】

: 用taq克隆了一段时间发现有突变，于是从stratagene买了pfu回来。。。
: 结果就杯具了。。。都摸了1周多条件了。。。
: 我要p的是cDNA，从公司买回来的vector。。。
: primer1的Tm在55度，primer2的Tm在57度。。。于是我annealing temp用50度走。。。
: 看到instructions说amplify cDNA，要加Mg到3mM。。。
: 于是我就照做了，
: 那次很幸运，出现了条带，可是我再用同样的条件去重复，就是出不来条带。。。
: 唉。。。

S*m2010-11-01 07:11

4 楼

同学,早该抛弃pfu了. 上NEB的Phusion吧.又快又好.

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-11-01 07:11

5 楼

我刚刚下了order。。。谢谢。。。

【在 S*******m 的大作中提到】

: 同学,早该抛弃pfu了. 上NEB的Phusion吧.又快又好.

B*o2010-11-01 07:11

6 楼

re这个，童叟无欺，劳动人民喜闻乐见啊

【在 S*******m 的大作中提到】

: 同学,早该抛弃pfu了. 上NEB的Phusion吧.又快又好.

s*s2010-11-01 07:11

7 楼

建议
1.pfu掺三倍taq, 用taq批，pfu校对
2.注意hot start
3.换酶，phusion/hifi taq

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-11-01 07:11

8 楼

1。您的意思是比如说50ul体系用0.2ul pfu, 加0.6ul taq？太多了吧。。。
2。pfu应该要hot start吗？
谢谢。。。

【在 s******s 的大作中提到】

: 建议
: 1.pfu掺三倍taq, 用taq批，pfu校对
: 2.注意hot start
: 3.换酶，phusion/hifi taq

s*r2010-11-01 07:11

9 楼

感觉你的annealing temp太低，引物加上酶切位点怎么也要过60度，一般用60到72度。

f*e2010-11-01 07:11

10 楼

pfu不是都有配好的2X buffer吗？主要是它的延申效率第一点 600b/min

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-11-01 07:11

11 楼

我是从commerical plasmid里面克隆cDNA，所以这个引物上面没有酶切位点。。。按照
IDT的Tm计算是50多，但是如果按finnzyme的算就过60了。。。

【在 s*******r 的大作中提到】

: 感觉你的annealing temp太低，引物加上酶切位点怎么也要过60度，一般用60到72度。

n*w2010-11-01 07:11

12 楼

嗯，它配好的里面Mg终浓度是2mM，但是mannual说要p cDNA的话，最好是用3mM的Mg，
于是我又加了一点，work了一次。。但是再后来我就重复不出来。。。
我的目的片段是2.3kb，我的reaction conditions是：
95度 4min
93度 1min
50度 1min
72度 1min
72度10min
4度 forever
跑30个循环。。。

【在 f*******e 的大作中提到】

: pfu不是都有配好的2X buffer吗？主要是它的延申效率第一点 600b/min

s*s2010-11-01 07:11

13 楼

0.1pfu+0.3taq，其实0.2+0.6也没关系，用pfu的buffer。
hotstart对所有难批的都至关重要。

【在 n***w 的大作中提到】

: 1。您的意思是比如说50ul体系用0.2ul pfu, 加0.6ul taq？太多了吧。。。
: 2。pfu应该要hot start吗？
: 谢谢。。。

s*s2010-11-01 07:11

14 楼

annealing太低，IDT算出来的都是不准的，建议用gradiant试一下52/55/57,
尤其多加Mg效果就类似降低annealing。另外用pfu你的延伸时间太短了。
建议用Taq+pfu, 注意hot start
94*2 －（94*0.5 -> 52/55/57*0.5 ->72*2) *35 cycle -4C

【在 n***w 的大作中提到】

: 嗯，它配好的里面Mg终浓度是2mM，但是mannual说要p cDNA的话，最好是用3mM的Mg，
: 于是我又加了一点，work了一次。。但是再后来我就重复不出来。。。
: 我的目的片段是2.3kb，我的reaction conditions是：
: 95度 4min
: 93度 1min
: 50度 1min
: 72度 1min
: 72度10min
: 4度 forever
: 跑30个循环。。。

S*m2010-11-01 07:11

15 楼

有一个事情没注意到.如果你的cDNA已经在载体上说明已经是双链了.镁离子应该同普通
PCR一样,用
1.5. 3mM是用于扩增作完RT之后的单链cDNA的.

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-11-01 07:11

16 楼

谢谢。我会试一下。我上面写错了，extension我用的是3分钟。

【在 S*******m 的大作中提到】

: 有一个事情没注意到.如果你的cDNA已经在载体上说明已经是双链了.镁离子应该同普通
: PCR一样,用
: 1.5. 3mM是用于扩增作完RT之后的单链cDNA的.

b*92010-11-01 07:11

17 楼

pfu的扩增效率的确有点低，最近扩出来的都是几百bp的小片段

n*w2010-11-01 07:11

18 楼

今天多加了点模版，然后用pfu和taq混合，3:1，pcr，条件没变，然后出了条带，然后
回收了。

j*k2010-11-01 07:11

19 楼

nod，熟练民工都用这个

【在 S*******m 的大作中提到】

: 同学,早该抛弃pfu了. 上NEB的Phusion吧.又快又好.

s*m2010-11-01 07:11

20 楼

大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的

【在 j**********k 的大作中提到】

: nod，熟练民工都用这个

s*m2010-11-01 07:11

21 楼

问题解决了没？
你说公司买的vector是什么意思？你给他们序列，他们给你合成的oligo？IDTDNA订的？
你第一次做出来的还保留着没？如果有可以试着gel purified一下，然后用它来做模板

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-11-01 07:11

22 楼

嗯，我今天把pfu和taq混一起跑了，跑出来了。然后切胶回收了。
谢谢。

的？

【在 s***m 的大作中提到】

: 问题解决了没？
: 你说公司买的vector是什么意思？你给他们序列，他们给你合成的oligo？IDTDNA订的？
: 你第一次做出来的还保留着没？如果有可以试着gel purified一下，然后用它来做模板

S*m2010-11-01 07:11

23 楼

当心突变.理论上讲pfu不会correct Taq 产生的错误.记得测序完了上来汇报一下.

【在 n***w 的大作中提到】

: 嗯，我今天把pfu和taq混一起跑了，跑出来了。然后切胶回收了。
: 谢谢。
:
: 的？

s*s2010-11-01 07:11

24 楼

你的理论是错误的，period

【在 S*******m 的大作中提到】

: 当心突变.理论上讲pfu不会correct Taq 产生的错误.记得测序完了上来汇报一下.

S*m2010-11-01 07:11

25 楼

Can you tell me why?

【在 s******s 的大作中提到】

: 你的理论是错误的，period

S*m2010-11-01 07:11

26 楼

I found the following paragraph on this webpage. I agree with him.
http://www.molecularstation.com/forum/microbiology-forum/20624-pfu-
polymerase-mixed-taq-polymerase.html
Pfu polymerase mixed with Taq polymerase
That won't work. Pfu is a polymerase. It's not capable of
proofreading without polymerizing. So, it won't follow Taq around and
act as a high fidelity proofreader. If you mix the two enzymes, you'll
have some strands of DNA that are high fidelity (which were synthesized
by Pfu), and other strands that will be low fidelity (which were
synthesized by Taq). The only solution here, as I see it, is to only
use Pfu if you are needing high fidelity reactions.

s*f2010-11-01 07:11

27 楼

哈哈，我知道一个实验室也是。
而且我一直用的都是pfu，从来没有p不出来的。

【在 s***m 的大作中提到】

: 大家真有钱
: 我们都是自己表达的pfu
: 不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的

s*r2010-11-01 07:11

28 楼

帖个纯化的protocol吧。

大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的

【在 s***m 的大作中提到】

: 大家真有钱
: 我们都是自己表达的pfu
: 不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的

b*n2010-11-01 07:11

29 楼

我靠，还真有这事情，还以为是在国内呢
咱们一起去开公司吧

【在 s***m 的大作中提到】

: 大家真有钱
: 我们都是自己表达的pfu
: 不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的

s*s2010-11-01 07:11

30 楼

都是理论家。
实际上，pfu+taq能比Taq大概准确6倍，显然不是一部分Taq合成，一部分pfu合成
就能解释的。你要能证明就算pfu一点错误也不出，也只有1/6的amplicon是Taq
合成的，实际上Taq用量要比pfu高。
我的解释是，polymerase在体外合成DNA是一个dynamic的过程，尤其是错配以后，
会导致Taq的移位不顺畅，造成减速/甚至掉落，然后高保真酶就会上去用3->5
exo活性把错配切掉，继续合成。

【在 S*******m 的大作中提到】

: I found the following paragraph on this webpage. I agree with him.
: http://www.molecularstation.com/forum/microbiology-forum/20624-pfu-
: polymerase-mixed-taq-polymerase.html
: Pfu polymerase mixed with Taq polymerase
: That won't work. Pfu is a polymerase. It's not capable of
: proofreading without polymerizing. So, it won't follow Taq around and
: act as a high fidelity proofreader. If you mix the two enzymes, you'll
: have some strands of DNA that are high fidelity (which were synthesized
: by Pfu), and other strands that will be low fidelity (which were
: synthesized by Taq). The only solution here, as I see it, is to only

S*m2010-11-01 07:11

31 楼

这个'6倍'是否有据可查? 另外,不是说用3倍于pfu的Taq吗?
减速说明合成还在继续,高保真酶怎样修复? 把pfu拽下来自己上去?
这个'掉落'有多大可能是一个很关键的问题.

【在 s******s 的大作中提到】

: 都是理论家。
: 实际上，pfu+taq能比Taq大概准确6倍，显然不是一部分Taq合成，一部分pfu合成
: 就能解释的。你要能证明就算pfu一点错误也不出，也只有1/6的amplicon是Taq
: 合成的，实际上Taq用量要比pfu高。
: 我的解释是，polymerase在体外合成DNA是一个dynamic的过程，尤其是错配以后，
: 会导致Taq的移位不顺畅，造成减速/甚至掉落，然后高保真酶就会上去用3->5
: exo活性把错配切掉，继续合成。

s*s2010-11-01 07:11

32 楼

6倍就是pfu的准确度，很多commercial的mix就这样称的，应该会有
实验证实，你可以自己去查。
Taq不是永动机，会fall off是常识，尤其是有mismatch，或者非正常
dNTPs. 在fall off的mismatch位置，pfu虽然浓度低，但是有相对优势。
Btw, Taq错配老是fall off也是不能用Taq批长片段的原因

【在 S*******m 的大作中提到】

: 这个'6倍'是否有据可查? 另外,不是说用3倍于pfu的Taq吗?
: 减速说明合成还在继续,高保真酶怎样修复? 把pfu拽下来自己上去?
: 这个'掉落'有多大可能是一个很关键的问题.

S*m2010-11-01 07:11

33 楼

我知道会fall off. 关键还是概率有多大.如果不掉下来,pfu上不去,对不对?
如果Taq错配老是fall off,那只用Taq时不是就有一个筛选的作用,有突变得不到全长;
而得到的全长
没有突变.

【在 s******s 的大作中提到】

: 6倍就是pfu的准确度，很多commercial的mix就这样称的，应该会有
: 实验证实，你可以自己去查。
: Taq不是永动机，会fall off是常识，尤其是有mismatch，或者非正常
: dNTPs. 在fall off的mismatch位置，pfu虽然浓度低，但是有相对优势。
: Btw, Taq错配老是fall off也是不能用Taq批长片段的原因

s*s2010-11-01 07:11

34 楼

yes, 如果extension时间足够短的话

【在 S*******m 的大作中提到】

: 我知道会fall off. 关键还是概率有多大.如果不掉下来,pfu上不去,对不对?
: 如果Taq错配老是fall off,那只用Taq时不是就有一个筛选的作用,有突变得不到全长;
: 而得到的全长
: 没有突变.

n*w2010-11-01 07:11

35 楼

上次买的phusion来了，然后用pfu+taq弄出来的做模版用phusion做，相当impressive
！！！！
回收率也不错，明天直接把pcr产物送过去测序看有没有mutation。估计周五就知道结
果了，大家也就别争拉。
谢谢各位的帮助。

s*s2010-11-01 07:11

36 楼

为啥不直接用phusion，这玩意很好使

impressive

【在 n***w 的大作中提到】

: 上次买的phusion来了，然后用pfu+taq弄出来的做模版用phusion做，相当impressive
: ！！！！
: 回收率也不错，明天直接把pcr产物送过去测序看有没有mutation。估计周五就知道结
: 果了，大家也就别争拉。
: 谢谢各位的帮助。

b*92010-11-01 07:11

37 楼

那这个扩出来会不会在末端加A呢？

【在 s******s 的大作中提到】

: 0.1pfu+0.3taq，其实0.2+0.6也没关系，用pfu的buffer。
: hotstart对所有难批的都至关重要。

s*s2010-11-01 07:11

38 楼

y

【在 b******9 的大作中提到】

: 那这个扩出来会不会在末端加A呢？