第一次做这个,还请大家多多指教。 因为目标蛋白大多在inclusion body里,所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过 柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole,洗液2含10 mM imidazole, 洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。 纯化后跑胶,发现elute后的蛋白不干净,跟小试相比有很多杂band,不过目标蛋白的 band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band,赫然在目标蛋白 处。 这是为什么呢?是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗? 谢谢!
suggestions: 1. dissolve inclusion body w/ 8M urea plus 10mM imidazole to block non- specifical binding 2. after loading, wash w/ buffer containing 10mM imidazole 3. use 10-300 mM imidazole gradient to elute Then you should be able to get the pure protein. btw, don't overload the column.
【在 v***a 的大作中提到】 : 第一次做这个,还请大家多多指教。 : 因为目标蛋白大多在inclusion body里,所以单独分离出并用6 M guanidine溶解后过 : 柱。洗液1、2、3都含有8 M urea。洗液1不含imidazole,洗液2含10 mM imidazole, : 洗液3含25 mM imidazole。最后用含200 mM imidazole的buffer来elute。 : 纯化后跑胶,发现elute后的蛋白不干净,跟小试相比有很多杂band,不过目标蛋白的 : band还是清晰的。问题是洗出液3中含有非常清晰且干净的一条band,赫然在目标蛋白 : 处。 : 这是为什么呢?是代表我的目标蛋白在25 mM imidazole时就会被洗脱吗? : 谢谢!