可以用Lambda Red同时两个两个的E. coli基因敲除吗？ - 未名空间MITBBS历史存档

可以用Lambda Red同时两个两个的E. coli基因敲除吗？# Biology - 生物学

Y*92012-02-07 08:02

1 楼

我是独生女，现在在国内，美国的绿卡排期马上要到了。
妈妈最近因为心脏病几次抢救，现在病状平稳了，可接踵而来的是脑梗赛导致行动不便
。糖尿病导致肾衰竭。
现在家里请了一个保姆，还有爸爸白天照顾，我和老公晚上下班后帮忙照顾，我小孩4
岁，上幼儿园。
我不知道如果绿卡拿到了还要不要回美国生活？如果妈妈真的不行了，爸爸怎么办？
最近一直在考虑这方面的问题，独生子女的压力，很重很重。。
我知道有不少JMS和我背景类似，可能现在在美国，但国内的父母，遇到这样的情况，
你们如何打算？
希望听听大家的想法。。。

h*r2012-02-07 08:02

2 楼

想用Wanner Lambda Red Gene Disruption系统敲除E. coli的6个基因，别人报道过了
，没有问题。
一个一个的敲费时啊，能不能同时转化两个PCR产物，分别用Km和Cm的抗性，筛选Km Cm
的抗性，然后切断marker,再做下一次的两个基因的敲除。
求建议！有包子！
多谢！

g*g2012-02-07 08:02

3 楼

你要是回国有能力赡养你父母就回去。不然就等绿卡，然后把他们接过来。

h*e2012-02-07 08:02

4 楼

只能说理论上可行，但是没实际做过
选择双抗的话效率不会高的

w*p2012-02-07 08:02

5 楼

先治病，其它再说。

l*12012-02-07 08:02

6 楼

老大或你老板能开发个Array knock out tool that can parallel 敲除任意N (N>2) N个基因 at E coli
next Yeast, fly, zebrafish, especially on Rat Mice Human at universal biomedical reactions pathway middle
point. then 这里的千老就能成墙街矿工或湾区龟公的生路喽
而你和你老板可以炸药奖或被至少被那个奖提名
of course, might should be done at Biosafety level P4 areas. -- not joke, Sure!
//en.wikipedia.org/wiki/Biosafety_level#Biosafety_level.C2.A04

Cm

【在 h**********r 的大作中提到】

: 想用Wanner Lambda Red Gene Disruption系统敲除E. coli的6个基因，别人报道过了
: ，没有问题。
: 一个一个的敲费时啊，能不能同时转化两个PCR产物，分别用Km和Cm的抗性，筛选Km Cm
: 的抗性，然后切断marker,再做下一次的两个基因的敲除。
: 求建议！有包子！
: 多谢！

f*u2012-02-07 08:02

7 楼

拿了绿卡也不需要天天在美国啊。什么都不办，半年来待个2,3天，顺便报税了。半个
回美证，2年回来一次。父母的身体很重要，个人的事情也要考虑周全。

h*r2012-02-07 08:02

8 楼

我老板不管我，自己瞎折腾。
给PNAS的原作者写了封信问这事儿，人家懒得搭理我。
不过你这推论也太离谱了，从e. coli到Rat Mice Human，从苦逼到炸药奖或被至少被
那个奖提名。
算了，我还是老老实实的挨个儿敲吧。
多谢！

y*n2012-02-07 08:02

9 楼

1. 父母为大
2. 排期到了再担心
3. 已经归了的话，其实也可以选择不担心了

4

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我是独生女，现在在国内，美国的绿卡排期马上要到了。
: 妈妈最近因为心脏病几次抢救，现在病状平稳了，可接踵而来的是脑梗赛导致行动不便
: 。糖尿病导致肾衰竭。
: 现在家里请了一个保姆，还有爸爸白天照顾，我和老公晚上下班后帮忙照顾，我小孩4
: 岁，上幼儿园。
: 我不知道如果绿卡拿到了还要不要回美国生活？如果妈妈真的不行了，爸爸怎么办？
: 最近一直在考虑这方面的问题，独生子女的压力，很重很重。。
: 我知道有不少JMS和我背景类似，可能现在在美国，但国内的父母，遇到这样的情况，
: 你们如何打算？
: 希望听听大家的想法。。。

l*12012-02-07 08:02

10 楼

是啊违反以下的游戏理论控制的可能性很大阿
2002 Nature paper E coli 多样性石头剪刀布的游戏理论控制
E coli 扩散表面积和 E coli的多样性成反比
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12110887
then just one question:
你那种省事的两个一起敲除和 E coli 扩散表面积操作哪一种对biodiversity 的影响更大啊?
might be a idea for later proposal.

【在 h**********r 的大作中提到】

: 我老板不管我，自己瞎折腾。
: 给PNAS的原作者写了封信问这事儿，人家懒得搭理我。
: 不过你这推论也太离谱了，从e. coli到Rat Mice Human，从苦逼到炸药奖或被至少被
: 那个奖提名。
: 算了，我还是老老实实的挨个儿敲吧。
: 多谢！

s*n2012-02-07 08:02

11 楼

bless

x*u2012-02-07 08:02

12 楼

I have finished a dozen of deletions in E coli and based on my experience
there is no way you can simultaneously knockout two genes using this Red
recombination method. The chances are very low if your PCR fragment has only
40-50 homologous region with your target gene. Without removing the
introduced FRT site could cause site-unspecific integration and the second
deletion could happen nowhere but your FRT site.

a*e2012-02-07 08:02

13 楼

bless.
Re -
父母为大

C*e2012-02-07 08:02

14 楼

借题歪个楼
有人成功把lambda red系统弄到别的bacteria里过么？
跟ecoli差得比较远的bacteria

j*32012-02-07 08:02

15 楼

顶这个

【在 y***n 的大作中提到】

: 1. 父母为大
: 2. 排期到了再担心
: 3. 已经归了的话，其实也可以选择不担心了
:
: 4

h*r2012-02-07 08:02

16 楼

有啊，garm-应该有不少。
印象中streptomyces也有这个应用（）。
不确定～～早期看的paper
red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing streptomyces
http://www.pnas.org/content/100/4/1541.long
不过做了些改造，用的是conjugation
另外可能recBCD还有些别的遗传限制系统啥的影响挺大的

s*i2012-02-07 08:02

17 楼

首先是稳定好自己和你爸爸妈妈的情绪。
至于以后的安排，似乎更应该征求你爸爸和丈夫的意见。
如果可以的话，还是把绿卡拿到吧，毕竟将来多一条路没什么不好。

4

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我是独生女，现在在国内，美国的绿卡排期马上要到了。
: 妈妈最近因为心脏病几次抢救，现在病状平稳了，可接踵而来的是脑梗赛导致行动不便
: 。糖尿病导致肾衰竭。
: 现在家里请了一个保姆，还有爸爸白天照顾，我和老公晚上下班后帮忙照顾，我小孩4
: 岁，上幼儿园。
: 我不知道如果绿卡拿到了还要不要回美国生活？如果妈妈真的不行了，爸爸怎么办？
: 最近一直在考虑这方面的问题，独生子女的压力，很重很重。。
: 我知道有不少JMS和我背景类似，可能现在在美国，但国内的父母，遇到这样的情况，
: 你们如何打算？
: 希望听听大家的想法。。。

R*o2012-02-07 08:02

18 楼

Bacillus 好像可以

【在 C*******e 的大作中提到】

: 借题歪个楼
: 有人成功把lambda red系统弄到别的bacteria里过么？
: 跟ecoli差得比较远的bacteria

c*l2012-02-07 08:02

19 楼

以你妈为先，其他都是浮云

M*52012-02-07 08:02

20 楼

估计成功率会很低，最好还是一个一个弄。

l*n2012-02-07 08:02

21 楼

唉，咱们这代独生子女真的好难办。
我家也差不多类似情况，父亲身边离不开人照顾，现在只有我妈一个人。
我很想归，可lg不太喜欢国内的环境。。。。

s*s2012-02-07 08:02

22 楼

streptomyces上的应用实际上并不是直接在streptomyces中用的，用E. coli穿梭一下
而已

【在 h**********r 的大作中提到】

: 有啊，garm-应该有不少。
: 印象中streptomyces也有这个应用（）。
: 不确定～～早期看的paper
: red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing streptomyces
: http://www.pnas.org/content/100/4/1541.long
: 不过做了些改造，用的是conjugation
: 另外可能recBCD还有些别的遗传限制系统啥的影响挺大的

m*i2012-02-07 08:02

23 楼

绿卡真的这么重要吗？

4

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我是独生女，现在在国内，美国的绿卡排期马上要到了。
: 妈妈最近因为心脏病几次抢救，现在病状平稳了，可接踵而来的是脑梗赛导致行动不便
: 。糖尿病导致肾衰竭。
: 现在家里请了一个保姆，还有爸爸白天照顾，我和老公晚上下班后帮忙照顾，我小孩4
: 岁，上幼儿园。
: 我不知道如果绿卡拿到了还要不要回美国生活？如果妈妈真的不行了，爸爸怎么办？
: 最近一直在考虑这方面的问题，独生子女的压力，很重很重。。
: 我知道有不少JMS和我背景类似，可能现在在美国，但国内的父母，遇到这样的情况，
: 你们如何打算？
: 希望听听大家的想法。。。

s*s2012-02-07 08:02

24 楼

Bacillus 的recombineering的目前尚无用Red系统的，刚审过一篇文章，应用的是Red
系统在Bacillus subtilis中，不久应该就会看到
在B. subtilis中应用其他phage recombinases的recombineering见这里：http://www.basysbio.org/file/Deliverables%200709/BaSysBio-Deliverable-1_1_4_public.pdf
不过欧洲的这个工作尚未发表，不知道为啥，也许是重复性不好。

【在 R*****o 的大作中提到】

: Bacillus 好像可以

c*l2012-02-07 08:02

25 楼

Bless.
Take care of parents and wait for GC at the same time.

F*p2012-02-07 08:02

26 楼

第一步效率低，但是理论上可行；第二步理论上不可行，会发生多个deletion,找不到
正确克隆.

Y*92012-02-07 08:02

27 楼

我现在就是在努力只考虑眼前的事情，努力照顾好家庭和父母，努力工作，努力把影响
降至最低。
我已经归了一段时间了，但原来申请的绿卡排期快到了，如果顺利的话通过应该没有问
题，可据说拿到绿卡要过去呆180天什么的，加之我看到自己独身子女的压力和难处，
很希望再生个孩子，不希望我的孩子将来也像我这样，连个商量的兄弟姐妹也没有，但
现实条件不允许了，也没有精力的，所以加重了着急程度。
坦率的说，结合这几年回国的感受，从长远来看，如果有机会在美国工作和生活的话，
我个人觉得，还是美国比较好，但人各有命，很多事情不是自己能决定的。
就这样吧，看来大家想法和我差不多，谢谢。

【在 c*******l 的大作中提到】

: Bless.
: Take care of parents and wait for GC at the same time.

l*12012-02-07 08:02

28 楼

http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31637503.html
8F
and down floors

【在 h**********r 的大作中提到】

: 我老板不管我，自己瞎折腾。
: 给PNAS的原作者写了封信问这事儿，人家懒得搭理我。
: 不过你这推论也太离谱了，从e. coli到Rat Mice Human，从苦逼到炸药奖或被至少被
: 那个奖提名。
: 算了，我还是老老实实的挨个儿敲吧。
: 多谢！

s*n2012-02-07 08:02

29 楼

排期到了就过来file上，然后回去等。有没有rfe，能不能批，看运气了。

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我现在就是在努力只考虑眼前的事情，努力照顾好家庭和父母，努力工作，努力把影响
: 降至最低。
: 我已经归了一段时间了，但原来申请的绿卡排期快到了，如果顺利的话通过应该没有问
: 题，可据说拿到绿卡要过去呆180天什么的，加之我看到自己独身子女的压力和难处，
: 很希望再生个孩子，不希望我的孩子将来也像我这样，连个商量的兄弟姐妹也没有，但
: 现实条件不允许了，也没有精力的，所以加重了着急程度。
: 坦率的说，结合这几年回国的感受，从长远来看，如果有机会在美国工作和生活的话，
: 我个人觉得，还是美国比较好，但人各有命，很多事情不是自己能决定的。
: 就这样吧，看来大家想法和我差不多，谢谢。

c*n2012-02-07 08:02

30 楼

bless

J*32012-02-07 08:02

31 楼

已经归了就不要想太多。排期到了过来拿绿卡，拿到后立刻申请个回美证就可以回去安
全呆2年了-拿到受理receipt就可以走人了，证可以以后叫人带回国。没有呆180的说法
。我以前就是拿了绿卡3个月的样子就走人，回美证是有人回国才帮我带回去的。期间
还说我照片不合格，我国内拍了发邮件到美国叫家里人重新邮寄去USCIS的。

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我现在就是在努力只考虑眼前的事情，努力照顾好家庭和父母，努力工作，努力把影响
: 降至最低。
: 我已经归了一段时间了，但原来申请的绿卡排期快到了，如果顺利的话通过应该没有问
: 题，可据说拿到绿卡要过去呆180天什么的，加之我看到自己独身子女的压力和难处，
: 很希望再生个孩子，不希望我的孩子将来也像我这样，连个商量的兄弟姐妹也没有，但
: 现实条件不允许了，也没有精力的，所以加重了着急程度。
: 坦率的说，结合这几年回国的感受，从长远来看，如果有机会在美国工作和生活的话，
: 我个人觉得，还是美国比较好，但人各有命，很多事情不是自己能决定的。
: 就这样吧，看来大家想法和我差不多，谢谢。

a*n2012-02-07 08:02

32 楼

2年后咋办呢？

【在 J********3 的大作中提到】

: 已经归了就不要想太多。排期到了过来拿绿卡，拿到后立刻申请个回美证就可以回去安
: 全呆2年了-拿到受理receipt就可以走人了，证可以以后叫人带回国。没有呆180的说法
: 。我以前就是拿了绿卡3个月的样子就走人，回美证是有人回国才帮我带回去的。期间
: 还说我照片不合格，我国内拍了发邮件到美国叫家里人重新邮寄去USCIS的。

g*82012-02-07 08:02

33 楼

bless

y*n2012-02-07 08:02

34 楼

你想太多了，庸人自扰。
1. 父母身体出了状况，作为儿女你现在的当务之急是服侍照顾好他们，你应该感到庆
幸你现在在国内，你有着这里绝大多数人没有的luxuary.
2. 儿孙自有儿孙福，一个也好，10个也好，大了他们自有他们的活法，有的亲兄弟还
同室操戈呢，你这个心操到什么时候有个了结？
3. 排期的事，不是说每个月都在恒递增的，也就是说你看VB离你的PD只差一个月了，
但可能真轮到你还得等一年。所以没current，就别操心了，尤其在你现在这个状态，
有点乱操心。
4. 归了，就好好归好，没有一个地方是完美的。如果归来归去的，你可能到头来还不
如当初不归。

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我现在就是在努力只考虑眼前的事情，努力照顾好家庭和父母，努力工作，努力把影响
: 降至最低。
: 我已经归了一段时间了，但原来申请的绿卡排期快到了，如果顺利的话通过应该没有问
: 题，可据说拿到绿卡要过去呆180天什么的，加之我看到自己独身子女的压力和难处，
: 很希望再生个孩子，不希望我的孩子将来也像我这样，连个商量的兄弟姐妹也没有，但
: 现实条件不允许了，也没有精力的，所以加重了着急程度。
: 坦率的说，结合这几年回国的感受，从长远来看，如果有机会在美国工作和生活的话，
: 我个人觉得，还是美国比较好，但人各有命，很多事情不是自己能决定的。
: 就这样吧，看来大家想法和我差不多，谢谢。

t*e2012-02-07 08:02

35 楼

bless,
1. get green card.
2. re-entry permit
180 days will only take into count in the future, when you need to apply
for the citizenship.

3. if you like to find a job here, apply again.
As a mom too, have you ever think, actually your happiness is the most
happiness of your mom?!
So get the best for you, and at the same time, support your mom and dad.
By the way, why you don't like to work in china?
I am thinking about go back, if I can get find a better title. and in a
stable career track, even if the money can't match.
because staying here make me worried about lay off every day.

【在 Y*****9 的大作中提到】

: 我现在就是在努力只考虑眼前的事情，努力照顾好家庭和父母，努力工作，努力把影响
: 降至最低。
: 我已经归了一段时间了，但原来申请的绿卡排期快到了，如果顺利的话通过应该没有问
: 题，可据说拿到绿卡要过去呆180天什么的，加之我看到自己独身子女的压力和难处，
: 很希望再生个孩子，不希望我的孩子将来也像我这样，连个商量的兄弟姐妹也没有，但
: 现实条件不允许了，也没有精力的，所以加重了着急程度。
: 坦率的说，结合这几年回国的感受，从长远来看，如果有机会在美国工作和生活的话，
: 我个人觉得，还是美国比较好，但人各有命，很多事情不是自己能决定的。
: 就这样吧，看来大家想法和我差不多，谢谢。

B*g2012-02-07 08:02

36 楼

你翻墙过来的？哈哈

【在 J********3 的大作中提到】

: 已经归了就不要想太多。排期到了过来拿绿卡，拿到后立刻申请个回美证就可以回去安
: 全呆2年了-拿到受理receipt就可以走人了，证可以以后叫人带回国。没有呆180的说法
: 。我以前就是拿了绿卡3个月的样子就走人，回美证是有人回国才帮我带回去的。期间
: 还说我照片不合格，我国内拍了发邮件到美国叫家里人重新邮寄去USCIS的。