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请问real-time PCR negative control的Ct值的问题

请问real-time PCR negative control的Ct值的问题# Biology - 生物学

s*a2012-06-21 07:06

1 楼

要做qRT-PCR检测一个gene expression level，请问negative control Ct要比sample
Ct大多少才能接受？我要检测一个gene的alternative spliced isoform，其中一个
isoform 1 的扩增结果会被平时用的plasmid污染，另一个 isoform 2 可能会受
genomic DNA污染。如果检测isoform 1，RT minus control的Ct value只比样品晚3个
cycle（Ct sample=26, Ct RT minus control=29, Ct GAPDH=17），相当于污染物是样
品target gene的1/8，这个污染程度能否接受？
另外我的total RNA做过turbo DNase digestion，如果要检测可能受到genomic DNA 污
染的isoform 2, 请问RT minus control的Ct值比样品大几个cycle才能接受?
补充一点，negative control melting peak已经确定不是primer-dimer而是target
gene contamination.

a*e2012-06-21 07:06

2 楼

your contamination is too much.
Ct for minus RT should be at least > 35

a*y2012-06-21 07:06

3 楼

agree
36 or 38 to be safer.
technically it is feasible to remove DNA better. so you should do it.

【在 a***e 的大作中提到】

: your contamination is too much.
: Ct for minus RT should be at least > 35

s*a2012-06-21 07:06

4 楼

Good to know. Thanks.
请问大家做real-time PCR都是在hood里面做吗？RNA isolation也在hood里? 实验条件
不好，很头痛

【在 a***e 的大作中提到】

: your contamination is too much.
: Ct for minus RT should be at least > 35

s*a2012-06-21 07:06

5 楼

没有hood，以前也没做过real-time，直接在自己bench上做的，没想到那么敏感。

【在 a***y 的大作中提到】

: agree
: 36 or 38 to be safer.
: technically it is feasible to remove DNA better. so you should do it.

a*y2012-06-21 07:06

6 楼

如果是gDNA没有除干净。不需要在hood里也做得出来
如果是plasmid污染……我还没有遇到过。别人出来解答吧。

【在 s*****a 的大作中提到】

: 没有hood，以前也没做过real-time，直接在自己bench上做的，没想到那么敏感。

A*y2012-06-21 07:06

7 楼

You don't need hood. What kit are you using for RNA isolation? There is a
reason Qiagen RNA kit is costly yet you still have to buy it. Don't use
other brand. DNase is also your friend, it won't hurt RNA at all.

a*g2012-06-21 07:06

8 楼

RT-negative 值太高；
很像是你的plasmid contaminate.否则要靠genomic DNA达到你的Ctvalue挺难的（当然
你的primer应该intron spanning...最好是TaqMan based method)
建议换水（买水，买新的primer-probe mix),借别的lab的枪, 用filter tips...

sample

【在 s*****a 的大作中提到】

: 要做qRT-PCR检测一个gene expression level，请问negative control Ct要比sample
: Ct大多少才能接受？我要检测一个gene的alternative spliced isoform，其中一个
: isoform 1 的扩增结果会被平时用的plasmid污染，另一个 isoform 2 可能会受
: genomic DNA污染。如果检测isoform 1，RT minus control的Ct value只比样品晚3个
: cycle（Ct sample=26, Ct RT minus control=29, Ct GAPDH=17），相当于污染物是样
: 品target gene的1/8，这个污染程度能否接受？
: 另外我的total RNA做过turbo DNase digestion，如果要检测可能受到genomic DNA 污
: 染的isoform 2, 请问RT minus control的Ct值比样品大几个cycle才能接受?
: 补充一点，negative control melting peak已经确定不是primer-dimer而是target
: gene contamination.

C*e2012-06-21 07:06

9 楼

Ambion的挺好的
我更喜欢它家的
另外你的这句话可能会误导
“DNase is also your friend, it won't hurt RNA at all.”
一般常用的DNase是有RNase在里面的
要用的话买的是DNase free RNase
不是随便拿来个DNase就好用

a

【在 A******y 的大作中提到】

: You don't need hood. What kit are you using for RNA isolation? There is a
: reason Qiagen RNA kit is costly yet you still have to buy it. Don't use
: other brand. DNase is also your friend, it won't hurt RNA at all.

s*a2012-06-21 07:06

10 楼

如果gDNA除干净了，是不是RT minus 的Ct>40？just curious..

【在 a***y 的大作中提到】

: 如果是gDNA没有除干净。不需要在hood里也做得出来
: 如果是plasmid污染……我还没有遇到过。别人出来解答吧。

s*a2012-06-21 07:06

11 楼

现在我提total RNA是用trizol+turbo DNase。我一直觉得trizol提的RNA质量最好，但
是看到很多人都用column提取做qRT-PCR的total RNA。请问为什么？是因为trizol麻烦
还是怕cross-contamination？

a

【在 A******y 的大作中提到】

s*a2012-06-21 07:06

12 楼

恩，isoform 1的primer是intron spanning的，所以不会扩增gDNA，但是会被用来做
cloning的plasmid污染。我现在已经准备换掉全套实验用具了，还有换别的实验室做。

当然

【在 a*****g 的大作中提到】

: RT-negative 值太高；
: 很像是你的plasmid contaminate.否则要靠genomic DNA达到你的Ctvalue挺难的（当然
: 你的primer应该intron spanning...最好是TaqMan based method)
: 建议换水（买水，买新的primer-probe mix),借别的lab的枪, 用filter tips...
:
: sample

s*a2012-06-21 07:06

13 楼

请问你用的是ambion的哪个kit? 提取cell culture和血液的total RNA用来做qRT-PCR
，哪些kit
好用？

【在 C*******e 的大作中提到】

: Ambion的挺好的
: 我更喜欢它家的
: 另外你的这句话可能会误导
: “DNase is also your friend, it won't hurt RNA at all.”
: 一般常用的DNase是有RNase在里面的
: 要用的话买的是DNase free RNase
: 不是随便拿来个DNase就好用
:
: a

C*e2012-06-21 07:06

14 楼

我不做cell culture和血液的
我做的细菌
用的细菌的kit
另外它们家还有column based mRNA enrichment kit
不过不知道有没有跟cell culture或者血液compatible的
如果是细菌的话要查一下不是每个菌都compatible的
可能会有bias

PCR

【在 s*****a 的大作中提到】

: 请问你用的是ambion的哪个kit? 提取cell culture和血液的total RNA用来做qRT-PCR
: ，哪些kit
: 好用？

l*12012-06-21 07:06

15 楼

if extract mRNA for your qRT-PCR
LZ just try this one:
Oligotex™-dT30 (Super) mRNA Purification Kit
Protocol in chinese version:
//www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=pdetail&newsid=185&subclass=1
how to get it in States:
//www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=link
or Qiagen similar kit:
//www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/oligotexsystem/
oligotexmini.aspx

PCR

【在 s*****a 的大作中提到】

: 请问你用的是ambion的哪个kit? 提取cell culture和血液的total RNA用来做qRT-PCR
: ，哪些kit
: 好用？