稳定转染的细胞还要继续加低浓度的G418吗？# Biology - 生物学
l*j
1 楼
用的1mg/ml G418筛选的稳定转染细胞，在后续的传代培养过程中，还要持续加低浓度
的G418吗？比如100ug/ml,10ug/ml, or 1ug/ml?
的G418吗？比如100ug/ml,10ug/ml, or 1ug/ml?
m*y
2 楼
继续低浓度，原来的十分之一即可
l*j
3 楼
我之前也是一直加100ug/ml，但是有一部分细胞的形态变了，是不是细胞有Stress呢？
我用的是HT1080，
而且时间长了，大概几个月之后， 用western 检测，tag标记蛋白减少或者消失了
【在 m***y 的大作中提到】
: 继续低浓度，原来的十分之一即可
我用的是HT1080，
而且时间长了，大概几个月之后， 用western 检测，tag标记蛋白减少或者消失了
【在 m***y 的大作中提到】
: 继续低浓度，原来的十分之一即可
m*y
4 楼
我就一直都没用G418筛选出来过，筛的过程中细胞形态就变了，原来的细胞可以紧紧贴
在plate上，后来细胞变了而且很容易detach.... G418筛选该怎么弄啊，实验室没人用
这个，没人请教。
在plate上，后来细胞变了而且很容易detach.... G418筛选该怎么弄啊，实验室没人用
这个，没人请教。
s*g
5 楼
先做个MTT筛一下细胞对G418的敏感性。看多高浓度G418能杀死大部风细胞。
然后转染。
把转染的细胞稀释放入培养皿中，等他们附着后（24和）加G418，这时候大部分细胞
浮起来了，换培养液（含G418），总有单个细胞能附着生长。由单个细胞长成克隆。然
后用小圆柱体收集单细胞克隆。
选8-10个克隆细胞分别放入8-10小培养皿中，继续加入抗生素，阔增细胞数量。。。。
然后转染。
把转染的细胞稀释放入培养皿中，等他们附着后（24和）加G418，这时候大部分细胞
浮起来了，换培养液（含G418），总有单个细胞能附着生长。由单个细胞长成克隆。然
后用小圆柱体收集单细胞克隆。
选8-10个克隆细胞分别放入8-10小培养皿中，继续加入抗生素，阔增细胞数量。。。。
t*2
6 楼
keep culturing in medium with half of the screening dosage of G418.
f*c
7 楼
According to some protocols, the concentration of G418 could be reduced for
maintaining. But I used the same concentration for both screening and
maintaining. It seems okay. Are there any problems?
【在 t*****2 的大作中提到】
: keep culturing in medium with half of the screening dosage of G418.
maintaining. But I used the same concentration for both screening and
maintaining. It seems okay. Are there any problems?
【在 t*****2 的大作中提到】
: keep culturing in medium with half of the screening dosage of G418.
z*t
8 楼
各位大侠们以前有谁做过leukemia cell line的G418筛选没？ 我尝试电转都不是特别
成功。。。
因为leukemia cell line是悬浮培养，加G418后很难区分死活。。。
胞
【在 s*****g 的大作中提到】
: 先做个MTT筛一下细胞对G418的敏感性。看多高浓度G418能杀死大部风细胞。
: 然后转染。
: 把转染的细胞稀释放入培养皿中，等他们附着后（24和）加G418，这时候大部分细胞
: 浮起来了，换培养液（含G418），总有单个细胞能附着生长。由单个细胞长成克隆。然
: 后用小圆柱体收集单细胞克隆。
: 选8-10个克隆细胞分别放入8-10小培养皿中，继续加入抗生素，阔增细胞数量。。。。
成功。。。
因为leukemia cell line是悬浮培养，加G418后很难区分死活。。。
胞
【在 s*****g 的大作中提到】
: 先做个MTT筛一下细胞对G418的敏感性。看多高浓度G418能杀死大部风细胞。
: 然后转染。
: 把转染的细胞稀释放入培养皿中，等他们附着后（24和）加G418，这时候大部分细胞
: 浮起来了，换培养液（含G418），总有单个细胞能附着生长。由单个细胞长成克隆。然
: 后用小圆柱体收集单细胞克隆。
: 选8-10个克隆细胞分别放入8-10小培养皿中，继续加入抗生素，阔增细胞数量。。。。
l*j
9 楼
看来大家一致认为都应该继续加G418，
只是maintaining的浓度不一样，可能具体多少浓度没太大影响，重要的是一直要加。
只是maintaining的浓度不一样，可能具体多少浓度没太大影响，重要的是一直要加。
g*n
10 楼
还在讨论？
细胞既然已经筛选好了，还加G418干吗？筛选时没杀死的细胞，这会儿加的G418就能杀
死了？特别是加低浓度G418。解心疑吗？
细胞既然已经筛选好了，还加G418干吗？筛选时没杀死的细胞，这会儿加的G418就能杀
死了？特别是加低浓度G418。解心疑吗？
b*r
11 楼
转进去的基因可能被甲基化或者deletion丢失
【在 g*****n 的大作中提到】
: 还在讨论？
: 细胞既然已经筛选好了，还加G418干吗？筛选时没杀死的细胞，这会儿加的G418就能杀
: 死了？特别是加低浓度G418。解心疑吗？
【在 g*****n 的大作中提到】
: 还在讨论？
: 细胞既然已经筛选好了，还加G418干吗？筛选时没杀死的细胞，这会儿加的G418就能杀
: 死了？特别是加低浓度G418。解心疑吗？
s*g
12 楼
多养些时间,死细胞就列解了.
【在 z*t 的大作中提到】
: 各位大侠们以前有谁做过leukemia cell line的G418筛选没？ 我尝试电转都不是特别
: 成功。。。
: 因为leukemia cell line是悬浮培养，加G418后很难区分死活。。。
:
: 胞
【在 z*t 的大作中提到】
: 各位大侠们以前有谁做过leukemia cell line的G418筛选没？ 我尝试电转都不是特别
: 成功。。。
: 因为leukemia cell line是悬浮培养，加G418后很难区分死活。。。
:
: 胞
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