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请教一个关于mRNA翻译的问题

请教一个关于mRNA翻译的问题# Biology - 生物学

c*i2012-09-23 07:09

1 楼

我在做一个RNA tethering assay in HEK293T，ORF1-stop codon- aptamer -KOZAK
-ORF2.
理论上ORF2蛋白是不应该表达，由于在终止密码子之后。但实验表明ORF2蛋白有表达，
并且表达量和转染的质粒量成线性关系。请问大家有没有这样的经验？十分感谢。

j*n2012-09-23 07:09

2 楼

当ORF1的start codon 附近序列不够强而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时
候根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的
按你这个设计，你再ORF2前面刻意加了Kozak序列客观条件具备所以ORF2被翻译也不
奇怪呀

c*i2012-09-23 07:09

3 楼

ORF1也有很强的kozak的，ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的，应该
不存在readthrough的问题。感觉很纠结。

【在 j******n 的大作中提到】

: 当ORF1的start codon 附近序列不够强而ORF2的start codon附近序列很适合翻译的时
: 候根据leaky scanning理论 ORF2会有一定强度的翻译的
: 按你这个设计，你再ORF2前面刻意加了Kozak序列客观条件具备所以ORF2被翻译也不
: 奇怪呀

s*y2012-09-23 07:09

4 楼

这个不一定需要是readthrough 啊，既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了

【在 c**i 的大作中提到】

: ORF1也有很强的kozak的，ORF1总长~1000bp。ORF2的ATG和ORF1不是In-frame的，应该
: 不存在readthrough的问题。感觉很纠结。

c*i2012-09-23 07:09

5 楼

这么说，ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么？这样即使第一
个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的，ORF2是luciferase，
untranfected的RLU是～500，有质粒的大约是1000倍，～300，000。感觉信号很强。

【在 s******y 的大作中提到】

: 这个不一定需要是readthrough 啊，既然你的ORF2 前面放有kozak sequence,
: ribosome initiation machinary很容易就直接跳到那里开始表达了

s*y2012-09-23 07:09

6 楼

咦？难道这个不是已经是公认的了么？
在我的理解中，在体内，Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
过去，而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配，
然后再扫描。所以，在中间开始是非常常见的事情，IRES element 不就是用来干
这个的么？

【在 c**i 的大作中提到】

: 这么说，ribosome是采用jump而不是scan的方式来寻找第一个kozak么？这样即使第一
: 个很强也可能被跳过。我的ORF1和2是相同的KOZAK的，ORF2是luciferase，
: untranfected的RLU是～500，有质粒的大约是1000倍，～300，000。感觉信号很强。

l*g2012-09-23 07:09

7 楼

CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译，并不会从中间的
initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。
LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site？

【在 s******y 的大作中提到】

: 咦？难道这个不是已经是公认的了么？
: 在我的理解中，在体内，Ribosome并不是真的要一直从5'-end结合上去然后一路扫描
: 过去，而是大小亚基在其他蛋白的帮助下在ribosome biding site 上直接装配，
: 然后再扫描。所以，在中间开始是非常常见的事情，IRES element 不就是用来干
: 这个的么？

s*y2012-09-23 07:09

8 楼

在我的理解中，5'-CAP structure 本质上就是一个strong ribosome assembling
signal 吧，然后装好了的ribosome 扫到第一个ATG就可以开始翻译了。
但是，很多RNA sequence, 尤其是Kozak sequence，也是可以启动ribosome
assembling的吧？楼主的第二个ORF 前面有Kozak sequence。
另外，即使是在CAP启动的翻译，如果两个ATG 距离得不远的话，我的记忆中
好像有时候也会跳过第一个ATG而在第二个开始。

【在 l******g 的大作中提到】

: CAP依赖的翻译机制好像scan到第一个intitiation site就开始翻译，并不会从中间的
: initiation开始。原核细胞里面倒是可以从一个mRNA的几个initation site开始。
: LZ的ORF1序列像不像IRES? 5'UTR到ORF2前面有没有不小心加的splicing site？

j*n2012-09-23 07:09

9 楼

这个问题在真核生物中一直有争论不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从
不同的起始密码子翻译出不同蛋白去了解下ATF-4基因就知道了楼主的情况完全在情
理之中

l*g2012-09-23 07:09

10 楼

看来我得买本新的分子生物学教科书来读读了，知识老化严重

【在 s******y 的大作中提到】

l*g2012-09-23 07:09

11 楼

看来工业界没一个明白人啊，我们作cell line的需要同时表达多个gene，都是用IRES
或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几
个起始密码的设计。

【在 j******n 的大作中提到】

: 这个问题在真核生物中一直有争论不过现在越来越多的证据显示一条mRNA仍然可能从
: 不同的起始密码子翻译出不同蛋白去了解下ATF-4基因就知道了楼主的情况完全在情
: 理之中

c*i2012-09-23 07:09

12 楼

感谢楼上诸位！
我一直以为cap－dependent的翻译是scan的在真核中，在没有特殊元件的情况下是不会
在中间起始翻译的。原来jump，leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。
我换个weak kozak试试。谢谢大家。

s*y2012-09-23 07:09

13 楼

工业界只用已经搞明白的机理，那种不明不白的，万一做错了就有来自上级的麻烦了。

IRES

【在 l******g 的大作中提到】

: 看来工业界没一个明白人啊，我们作cell line的需要同时表达多个gene，都是用IRES
: 或者多个promoter转录出几个mRNA, 做出的质粒超级大。还没看到过用一个promoter几
: 个起始密码的设计。

l*12012-09-23 07:09

14 楼

RE: LZ
if weaker Kozak still got ORF2 expression
可能有TRE/Retrotransposon working.
pls refer:
Grabundzija I et al. (2010)
Comparative Analysis of Transposable Element Vector Systems in Human Cells
Mol Ther. 18: 1200–1209.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2889740/
or
one Finnish PhD thesis (2011)
its title:
'The Transcriptional Regulation of Retrotransposon BARE’
full text pdf file link:
https://helda.helsinki.fi/handle/10138/28135

【在 c**i 的大作中提到】

: 感谢楼上诸位！
: 我一直以为cap－dependent的翻译是scan的在真核中，在没有特殊元件的情况下是不会
: 在中间起始翻译的。原来jump，leaky scan和reinitiate都是会在一定程度发生的。
: 我换个weak kozak试试。谢谢大家。