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求助:用质谱鉴定蛋白
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求助:用质谱鉴定蛋白# Biology - 生物学
f*y
1
准备和CO-PI合写proposal
把自己之前写的,还在pending的proposal给CO-PI看是否合适?
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w*4
2
用的小觅的山核桃香蕉蛋糕方子。基本都是按方子来的。
材料(16个标准纸杯的量):
鸡蛋4个,细砂糖60g,低筋面粉(cake flour)120g,熟透的大香蕉1支(约120g),
山核桃仁适量。
做法:
1、熟透的香蕉用勺子压成泥。
2、用手持电动打蛋器的高速档将鸡蛋打至发泡变白,约6-7分钟,期间分3次加入细砂
糖。
3、将低筋面粉过筛加入蛋糊中,用橡皮刮刀翻拌均匀。
4、倒入香蕉泥翻拌匀。
5、将蛋糕糊舀入模具中,八分满,撒上山核桃仁。
6、烤箱预热390℉(约200℃),烤13-15分钟。
今天特意吃了个别人带的cupcake,很松软梦幻的感觉,为啥我做的感觉发硬呢?从组
织上看,空洞比今天吃的稍大些。是鸡蛋打过了?
还有个问题,把面粉筛到盆里的时候,是不是分散些好,我第一次做都筛到中间了,刮
刀翻拌的时候老发现干面粉,当时有些担心气泡会被弄没了。还想问小觅,4个鸡蛋的
量,我用的跟你一样的模具,只有12个,剩下的估计也许不止四个,但昨天太晚了就把
糊糊给倒了,你是又烤一次吗?
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w*r
3
我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
分感谢!
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s*y
4
我觉得,如果对某个合作者需要这么戒备的话,那么对方不是你的合适的合作者。

【在 f*****y 的大作中提到】
: 准备和CO-PI合写proposal
: 把自己之前写的,还在pending的proposal给CO-PI看是否合适?

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s*n
5
“基本”按方子
你什么地方没有按方子,可能就是出问题的地方
另外,鸡蛋个头差异很大的
小鸡蛋一个连壳50克,大的能有70克,4个鸡蛋,能差好多呢
香蕉的个头差异也很大
鸡蛋打够时间没?
混合面粉的时候是不是用力搅了很久?
都可能影响成品的
另外你吃的别人的cupcake,用的不一样的方子,口感当然可能不一样了

【在 w*****4 的大作中提到】
: 用的小觅的山核桃香蕉蛋糕方子。基本都是按方子来的。
: 材料(16个标准纸杯的量):
: 鸡蛋4个,细砂糖60g,低筋面粉(cake flour)120g,熟透的大香蕉1支(约120g),
: 山核桃仁适量。
: 做法:
: 1、熟透的香蕉用勺子压成泥。
: 2、用手持电动打蛋器的高速档将鸡蛋打至发泡变白,约6-7分钟,期间分3次加入细砂
: 糖。
: 3、将低筋面粉过筛加入蛋糊中,用橡皮刮刀翻拌均匀。
: 4、倒入香蕉泥翻拌匀。

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a*n
6
有时候marker不一定准确,买到抗体验证一下相互作用吧

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
: 分感谢!

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w*4
7
时间应该够了,甚至更长,但我第一次用hand mixer哦,也不知道打成啥样靠谱,觉得
也打了那么长时间了就开始放面粉了。搅拌的时候,特意看小觅说从边上下铲子,从底
兜上来,我也是这么弄滴呀,就是面粉都撒中间了,拌了有一会子,但如果拌时间长了
,气泡出去多了,应该成品蜂窝少吧?这么说还是我打蛋打过了的缘故吧?称重量的都
一点不差。如果鸡蛋大口感会咋样呢?

【在 s**n 的大作中提到】
: “基本”按方子
: 你什么地方没有按方子,可能就是出问题的地方
: 另外,鸡蛋个头差异很大的
: 小鸡蛋一个连壳50克,大的能有70克,4个鸡蛋,能差好多呢
: 香蕉的个头差异也很大
: 鸡蛋打够时间没?
: 混合面粉的时候是不是用力搅了很久?
: 都可能影响成品的
: 另外你吃的别人的cupcake,用的不一样的方子,口感当然可能不一样了

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w*r
8
应该不是marker的问题,质谱分析结果里丰度排在那个70KD蛋白下面的就有一个60KD左
右的蛋白还有一个50多KD的蛋白。如果从跑胶结果看的话,那个切下来的条带离70还很
远呢,不可能有70多KD。Anyway, 谢谢回复啊。

【在 a*****n 的大作中提到】
: 有时候marker不一定准确,买到抗体验证一下相互作用吧
:
: pull

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s*n
9
你刚开始做蛋糕,对时间的感觉很有可能不准的
不是看时间,要看状态,方子里形容了的,照着做
不要打不够,也不要打过头
面粉过筛了没?不过筛,都结块,可能拌不匀
鸡蛋大,口感当然好

【在 w*****4 的大作中提到】
: 时间应该够了,甚至更长,但我第一次用hand mixer哦,也不知道打成啥样靠谱,觉得
: 也打了那么长时间了就开始放面粉了。搅拌的时候,特意看小觅说从边上下铲子,从底
: 兜上来,我也是这么弄滴呀,就是面粉都撒中间了,拌了有一会子,但如果拌时间长了
: ,气泡出去多了,应该成品蜂窝少吧?这么说还是我打蛋打过了的缘故吧?称重量的都
: 一点不差。如果鸡蛋大口感会咋样呢?

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A*y
10
Who cares? Your MS is biased anyway. Just do further molecular biology to
validate your pull-down. Also, did you run a midi-gel or mini-gel? If you
run a mini-gel, your gel resolution might not be high enough that you can
cut close enough to isolate specific MW proteins. Run a midi-gel might help.

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
: 分感谢!

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w*4
11
谢谢薯条娘~ 面粉是筛过了的。方子里说打到发白起泡,但没亲自看别人做过心理没有
预期的,还真不知是啥样(嫌俺笨的诸位就别往下看了。。。),也不知道啥样是不够
,啥样是过头:( 根据成品组织蜂窝比较大,姑且认为还是打过了吧。下次照个照片
吧,我家相机常常几个月也不咋动,照相再传上来,再修改尺寸,真是好麻烦呀

【在 s**n 的大作中提到】
: 你刚开始做蛋糕,对时间的感觉很有可能不准的
: 不是看时间,要看状态,方子里形容了的,照着做
: 不要打不够,也不要打过头
: 面粉过筛了没?不过筛,都结块,可能拌不匀
: 鸡蛋大,口感当然好

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p*p
12
Have you looked at the protein to see if there's a signal peptide?

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
: 分感谢!

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o*4
13
这种现象很正常,没有关系,
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I*y
14
70KD的蛋白可能跑低了,60KD的蛋白有可能跑到80KD啊,这个不能一概而论。如果你切
的没错,质谱的结果就靠谱

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
: 分感谢!

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w*r
15
如果是这样的话,难道这个药同时结合了至少3种蛋白?!因为这个70KD的蛋白和另外
两个60KD的蛋白在control里完全没检测到,只在pull down里才有。

【在 I*****y 的大作中提到】
: 70KD的蛋白可能跑低了,60KD的蛋白有可能跑到80KD啊,这个不能一概而论。如果你切
: 的没错,质谱的结果就靠谱
:
: pull

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K*S
16
I would say you are extremely lucky if your drug can only interact with 3
unique proteins. The whole workflow is called chemical proteomics and it's a
very mature workflow. The only purpose of running a gel is to do some crude
separation. Majority of ppl cut out the whole lane and use MS to detect
everything then compare.

【在 w*******r 的大作中提到】
: 如果是这样的话,难道这个药同时结合了至少3种蛋白?!因为这个70KD的蛋白和另外
: 两个60KD的蛋白在control里完全没检测到,只在pull down里才有。

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s*s
17
PAGE上的size不能当真理。再说,还可能有很多neg charge的modification

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
: 分感谢!

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A*y
18
Watch it is going to be tubulin...
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W*7
19
1 蛋白跑得远近不只是看分子量,还要看charge的,还有,也不是所有的修饰都是使蛋
白跑的更慢,也有让蛋白跑得快的。
2 你pull down的蛋白也许有degradation。。。
3 蛋白marker有时候真的不准。。。
所以,以质谱结果为准,既然有了结果,就无论如何都要验证下去。。。
good luck!
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b*0
20
1. 那个70多kD 是根据amino acid sequence推算出来的理论值,不是真正在gel
migration上的位置。
2. 同样的蛋白用同样的ladder在不同的gel(invitrogen bis-tris, Bio-rad Tris-
glycine 系统上跑出来的都可能差10kD左右。)
3. MS给出的结果一般是比较靠谱的,尤其是SC(spectrum counts, e.g., sequenced
times)
4. 如果能弄到相关抗体的话, 可以做个western就可以确认了。
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T*O
21
1) 质谱丰度受仪器条件影响非常大,不应单独作为定量判据。
2) 任何分离方法都不是绝对的。
比如你的60带里残留很少的70,仅能被质谱检出。而恰好在当时的质谱条件下,检测器
抓到了更多的70离子。

pull

【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads,实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是,我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白,这是怎么回事?如果是个小于60KD的蛋白,那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶,会有70多KD的蛋白呢?这个蛋白有两个isoform,
: 都是70多KD,查了文献,也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解,求高手解惑。万
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