作Gel filtration分离蛋白，总是聚集# Biology - 生物学
a*g
1 楼
最近在做蛋白纯化，发现蛋白很不稳定，用gel filtration分离的时候蛋白总聚集在一
起，只有一个峰，但是SDS-PAGE提示并没有分开，杂带也在里面。
有什么好的方法可以使它变成稳定的单体呢？
起，只有一个峰，但是SDS-PAGE提示并没有分开，杂带也在里面。
有什么好的方法可以使它变成稳定的单体呢？
a*k
2 楼
完全没看懂。。。
你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？
【在 a********g 的大作中提到】
: 最近在做蛋白纯化，发现蛋白很不稳定，用gel filtration分离的时候蛋白总聚集在一
: 起，只有一个峰，但是SDS-PAGE提示并没有分开，杂带也在里面。
: 有什么好的方法可以使它变成稳定的单体呢？
你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？
【在 a********g 的大作中提到】
: 最近在做蛋白纯化，发现蛋白很不稳定，用gel filtration分离的时候蛋白总聚集在一
: 起，只有一个峰，但是SDS-PAGE提示并没有分开，杂带也在里面。
: 有什么好的方法可以使它变成稳定的单体呢？
l*g
3 楼
乖乖，这连珠炮响的，其实只说最后一句就够了，多大的蛋白和什么样的筛子。
【在 a****k 的大作中提到】
: 完全没看懂。。。
: 你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
: fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？
【在 a****k 的大作中提到】
: 完全没看懂。。。
: 你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
: fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？
a*k
4 楼
哈哈，我这是生动的表现出了看帖子时满脑子的疑问...$^#&%#@
【在 l******g 的大作中提到】
: 乖乖，这连珠炮响的，其实只说最后一句就够了，多大的蛋白和什么样的筛子。
【在 l******g 的大作中提到】
: 乖乖，这连珠炮响的，其实只说最后一句就够了，多大的蛋白和什么样的筛子。
a*g
5 楼
抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
才能勉强跑胶。
怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
50mM Tris-HCl, pH8.5.
【在 a****k 的大作中提到】
: 哈哈，我这是生动的表现出了看帖子时满脑子的疑问...$^#&%#@
我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
才能勉强跑胶。
怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
50mM Tris-HCl, pH8.5.
【在 a****k 的大作中提到】
: 哈哈，我这是生动的表现出了看帖子时满脑子的疑问...$^#&%#@
a*k
6 楼
没做个这么小的蛋白，在那个60kd的峰里应该主要还是你的蛋白吧？如果是的话，我猜
你的蛋白很可能是以oligomer存在的（当然，根据我们的课本知识，gel filtration不
光是size有影响，还有structure。。。）注意到你buffer的盐浓度算是有点高的了，
在这样的浓度下还能结合的，应该属于interaction比较强了吧。不知道具体是个什么
蛋白，但是根据自己的经验，如果是这样的话，monomer很可能是没有activity的，必
须要以这样的形式存在才行。你在60kd看到的其他杂带有可能是因为他们本身就是那个
size附近的，或者试试ion exchange来去除杂蛋白？如果一定要用gel filtration，可
以在前面加一步ammonium sulfate precipitation试试，有可能把你的蛋白和杂蛋白分
开一些，但是这个就要摸条件了
NaCl,
【在 a********g 的大作中提到】
: 抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
: 我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
: 化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
: 现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
: 才能勉强跑胶。
: 怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
: 50mM Tris-HCl, pH8.5.
你的蛋白很可能是以oligomer存在的（当然，根据我们的课本知识，gel filtration不
光是size有影响，还有structure。。。）注意到你buffer的盐浓度算是有点高的了，
在这样的浓度下还能结合的，应该属于interaction比较强了吧。不知道具体是个什么
蛋白，但是根据自己的经验，如果是这样的话，monomer很可能是没有activity的，必
须要以这样的形式存在才行。你在60kd看到的其他杂带有可能是因为他们本身就是那个
size附近的，或者试试ion exchange来去除杂蛋白？如果一定要用gel filtration，可
以在前面加一步ammonium sulfate precipitation试试，有可能把你的蛋白和杂蛋白分
开一些，但是这个就要摸条件了
NaCl,
【在 a********g 的大作中提到】
: 抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
: 我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
: 化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
: 现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
: 才能勉强跑胶。
: 怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
: 50mM Tris-HCl, pH8.5.
a*g
7 楼
谢谢你的建议！我的蛋白是个RING DOMAIN结构域，本身是有活性的，我是按照一篇文
献做的，他们竟然不加锌，我第一次先按照他们的做，我也没加。但是我想下次加上锌
或许会好点？
【在 a****k 的大作中提到】
: 没做个这么小的蛋白，在那个60kd的峰里应该主要还是你的蛋白吧？如果是的话，我猜
: 你的蛋白很可能是以oligomer存在的（当然，根据我们的课本知识，gel filtration不
: 光是size有影响，还有structure。。。）注意到你buffer的盐浓度算是有点高的了，
: 在这样的浓度下还能结合的，应该属于interaction比较强了吧。不知道具体是个什么
: 蛋白，但是根据自己的经验，如果是这样的话，monomer很可能是没有activity的，必
: 须要以这样的形式存在才行。你在60kd看到的其他杂带有可能是因为他们本身就是那个
: size附近的，或者试试ion exchange来去除杂蛋白？如果一定要用gel filtration，可
: 以在前面加一步ammonium sulfate precipitation试试，有可能把你的蛋白和杂蛋白分
: 开一些，但是这个就要摸条件了
:
献做的，他们竟然不加锌，我第一次先按照他们的做，我也没加。但是我想下次加上锌
或许会好点？
【在 a****k 的大作中提到】
: 没做个这么小的蛋白，在那个60kd的峰里应该主要还是你的蛋白吧？如果是的话，我猜
: 你的蛋白很可能是以oligomer存在的（当然，根据我们的课本知识，gel filtration不
: 光是size有影响，还有structure。。。）注意到你buffer的盐浓度算是有点高的了，
: 在这样的浓度下还能结合的，应该属于interaction比较强了吧。不知道具体是个什么
: 蛋白，但是根据自己的经验，如果是这样的话，monomer很可能是没有activity的，必
: 须要以这样的形式存在才行。你在60kd看到的其他杂带有可能是因为他们本身就是那个
: size附近的，或者试试ion exchange来去除杂蛋白？如果一定要用gel filtration，可
: 以在前面加一步ammonium sulfate precipitation试试，有可能把你的蛋白和杂蛋白分
: 开一些，但是这个就要摸条件了
:
b*n
8 楼
我想到的两个解释
1）你的蛋白切掉GST之后本身aggregate或者形成oligomer
2）看你的GST是怎么切的，如果是in column digestion，有可能是molecular
chaperone
bind到你的蛋白上了。检测的办法是不用thrombin消化，先直接elute下来，跑电泳看
是不是有量比较大的杂带存在。
NaCl,
【在 a********g 的大作中提到】
: 抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
: 我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
: 化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
: 现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
: 才能勉强跑胶。
: 怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
: 50mM Tris-HCl, pH8.5.
1）你的蛋白切掉GST之后本身aggregate或者形成oligomer
2）看你的GST是怎么切的，如果是in column digestion，有可能是molecular
chaperone
bind到你的蛋白上了。检测的办法是不用thrombin消化，先直接elute下来，跑电泳看
是不是有量比较大的杂带存在。
NaCl,
【在 a********g 的大作中提到】
: 抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
: 我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
: 化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
: 现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
: 才能勉强跑胶。
: 怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
: 50mM Tris-HCl, pH8.5.
m*5
9 楼
swphadex g75有这个分辨率么？
a*g
10 楼
我很同意你的观点，就是切掉GST 就不稳定了，当我浓缩的时候还会沉淀，不切GST的
时候可以浓缩的非常浓也没问题。
我是用的pGEX-６P-１plasmid， in column digestion 用的Precission protease，从
GE healthcare买的。
如果直接Elution GST fusion protein的话，确实有杂带。
那我怎么才能把molecular chaperone去掉呢？本人医学背景对这方面不太在行，多谢
指教。
【在 b******n 的大作中提到】
: 我想到的两个解释
: 1）你的蛋白切掉GST之后本身aggregate或者形成oligomer
: 2）看你的GST是怎么切的，如果是in column digestion，有可能是molecular
: chaperone
: bind到你的蛋白上了。检测的办法是不用thrombin消化，先直接elute下来，跑电泳看
: 是不是有量比较大的杂带存在。
:
: NaCl,
时候可以浓缩的非常浓也没问题。
我是用的pGEX-６P-１plasmid， in column digestion 用的Precission protease，从
GE healthcare买的。
如果直接Elution GST fusion protein的话，确实有杂带。
那我怎么才能把molecular chaperone去掉呢？本人医学背景对这方面不太在行，多谢
指教。
【在 b******n 的大作中提到】
: 我想到的两个解释
: 1）你的蛋白切掉GST之后本身aggregate或者形成oligomer
: 2）看你的GST是怎么切的，如果是in column digestion，有可能是molecular
: chaperone
: bind到你的蛋白上了。检测的办法是不用thrombin消化，先直接elute下来，跑电泳看
: 是不是有量比较大的杂带存在。
:
: NaCl,
a*g
11 楼
因为我的蛋白杂带比较少，位置也比较高，并且我只有这一种柱子：（
【在 m******5 的大作中提到】
: swphadex g75有这个分辨率么？
【在 m******5 的大作中提到】
: swphadex g75有这个分辨率么？
b*n
12 楼
对付molecular chaperone的一个好方法是加Mg-ATP
具体就是Precission protease digestion之前柱子先用含5mM ATP和5mM Mg2+以及10%
的glycerol的wash solution（其他盐的浓度不变）洗几个bed volume，incubate半小
时，然后就可以elute下来检测纯度，如果杂带大幅缩减了，就说明条件摸对了,以后依
法操作之后再in column digestion
至于切掉GST不稳定这个就没啥太多办法，过度表达的蛋白很多都是folding不好的
hydrophobic patch暴露很多要么aggregate，要不招来molecular chaperone
除非你费力去refolding，或者摸表达条件
【在 a********g 的大作中提到】
: 我很同意你的观点，就是切掉GST 就不稳定了，当我浓缩的时候还会沉淀，不切GST的
: 时候可以浓缩的非常浓也没问题。
: 我是用的pGEX-６P-１plasmid， in column digestion 用的Precission protease，从
: GE healthcare买的。
: 如果直接Elution GST fusion protein的话，确实有杂带。
: 那我怎么才能把molecular chaperone去掉呢？本人医学背景对这方面不太在行，多谢
: 指教。
具体就是Precission protease digestion之前柱子先用含5mM ATP和5mM Mg2+以及10%
的glycerol的wash solution（其他盐的浓度不变）洗几个bed volume，incubate半小
时，然后就可以elute下来检测纯度，如果杂带大幅缩减了，就说明条件摸对了,以后依
法操作之后再in column digestion
至于切掉GST不稳定这个就没啥太多办法，过度表达的蛋白很多都是folding不好的
hydrophobic patch暴露很多要么aggregate，要不招来molecular chaperone
除非你费力去refolding，或者摸表达条件
【在 a********g 的大作中提到】
: 我很同意你的观点，就是切掉GST 就不稳定了，当我浓缩的时候还会沉淀，不切GST的
: 时候可以浓缩的非常浓也没问题。
: 我是用的pGEX-６P-１plasmid， in column digestion 用的Precission protease，从
: GE healthcare买的。
: 如果直接Elution GST fusion protein的话，确实有杂带。
: 那我怎么才能把molecular chaperone去掉呢？本人医学背景对这方面不太在行，多谢
: 指教。
a*g
13 楼
非常感谢！
【在 b******n 的大作中提到】
: 对付molecular chaperone的一个好方法是加Mg-ATP
: 具体就是Precission protease digestion之前柱子先用含5mM ATP和5mM Mg2+以及10%
: 的glycerol的wash solution（其他盐的浓度不变）洗几个bed volume，incubate半小
: 时，然后就可以elute下来检测纯度，如果杂带大幅缩减了，就说明条件摸对了,以后依
: 法操作之后再in column digestion
: 至于切掉GST不稳定这个就没啥太多办法，过度表达的蛋白很多都是folding不好的
: hydrophobic patch暴露很多要么aggregate，要不招来molecular chaperone
: 除非你费力去refolding，或者摸表达条件
【在 b******n 的大作中提到】
: 对付molecular chaperone的一个好方法是加Mg-ATP
: 具体就是Precission protease digestion之前柱子先用含5mM ATP和5mM Mg2+以及10%
: 的glycerol的wash solution（其他盐的浓度不变）洗几个bed volume，incubate半小
: 时，然后就可以elute下来检测纯度，如果杂带大幅缩减了，就说明条件摸对了,以后依
: 法操作之后再in column digestion
: 至于切掉GST不稳定这个就没啥太多办法，过度表达的蛋白很多都是folding不好的
: hydrophobic patch暴露很多要么aggregate，要不招来molecular chaperone
: 除非你费力去refolding，或者摸表达条件
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