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救急，pull down 问题！谢谢！

救急，pull down 问题！谢谢！# Biology - 生物学

w*a2013-02-26 08:02

1 楼

周杰伦组比汪峰组精彩太多，学员实力本来就强，选歌也对路。同时留下很对遗憾。第
一组低调组合胜出在意料之中，但是小程唱得真心不差。第二组善良竟然被加拿大华人
淘汰，太意外了。第三组，我个人很喜欢包包的调调，包包的发挥也比安河桥更好，音
域更宽，不能不觉得吃了颜值的亏。而第四组那个新加坡富二代，我根本就没听完，我
承认他长得像费翔，但是...

d*k2013-02-26 08:02

2 楼

哪位给总结一下？
想买个240G的SSD。

s*a2013-02-26 08:02

3 楼

我的实验很简单，GST-A （200KD）, His -B （100KD），验证它们结合。
1，首先，分子量这么大的蛋白，来做 pull down 实验，靠谱么？还是用片段，而不是
全长，会好些？
2，现在裂解完菌液后，特别粘稠（也加了DNase I），有什么好办法么？我发现裂解
完再超声一下，不再粘稠，但western后发现，超声后蛋白变没了。
3，western 后发现，His-B 高表达，但过完柱子纯化后（pierce kit），反而没有了
，奇怪！
请问大家上面这些问题遇到过么？谢谢！

i*y2013-02-26 08:02

4 楼

除了最后一组，我选的都和周不一样
不知道是不是我乐感不足，居然和周董差这么多

【在 w**a 的大作中提到】

: 周杰伦组比汪峰组精彩太多，学员实力本来就强，选歌也对路。同时留下很对遗憾。第
: 一组低调组合胜出在意料之中，但是小程唱得真心不差。第二组善良竟然被加拿大华人
: 淘汰，太意外了。第三组，我个人很喜欢包包的调调，包包的发挥也比安河桥更好，音
: 域更宽，不能不觉得吃了颜值的亏。而第四组那个新加坡富二代，我根本就没听完，我
: 承认他长得像费翔，但是...

s*e2013-02-26 08:02

5 楼

1. 我做过最大的是40kD vs 50kD，其实最重要的是解离常数，太高的话恐怕pull-down
的敏感度达不到；
2. 超声丢蛋白不太常见，你确认超声时候保持低温了吗？有时超声带来的高温会使蛋
白质变性；
3. 有可能是纯化条件没有优化好，有兴趣的话可以找个你们实验室做的成熟的His tag
蛋白做阳性参照试试你的纯化操作和试剂盒，或者换Qiagen的NTA或Clontech的talon
resin试一下。
祝你好运

l*p2013-02-26 08:02

6 楼

精彩个屁
一个接一个外F
尼玛就找不到能好好给中国人唱歌的人了

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 13

【在 w**a 的大作中提到】

s*a2013-02-26 08:02

7 楼

谢谢这位兄弟这么详细的回答。
1，我打算用不同的片段再试试。同时打算试试 in vitro expression system。Pierce
有这样的KIT，不知效果怎么样。
2，超声的时候确实在冰水里超的，3次，每次15s，间隔15s。确实挺奇怪的。大家都是
怎么去除粘稠这个问题的？
谢谢！

down
tag

【在 s*******e 的大作中提到】

: 1. 我做过最大的是40kD vs 50kD，其实最重要的是解离常数，太高的话恐怕pull-down
: 的敏感度达不到；
: 2. 超声丢蛋白不太常见，你确认超声时候保持低温了吗？有时超声带来的高温会使蛋
: 白质变性；
: 3. 有可能是纯化条件没有优化好，有兴趣的话可以找个你们实验室做的成熟的His tag
: 蛋白做阳性参照试试你的纯化操作和试剂盒，或者换Qiagen的NTA或Clontech的talon
: resin试一下。
: 祝你好运

w*a2013-02-26 08:02

8 楼

你不爱看可以不看啊。你管不着别人爱看。

【在 l**p 的大作中提到】

: 精彩个屁
: 一个接一个外F
: 尼玛就找不到能好好给中国人唱歌的人了
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 13

d*h2013-02-26 08:02

9 楼

没做过这么大的蛋白
不过感觉你超的次数太少，还有超的时候，要确保管子没有热，如果热间隔时间要长一
些。
不知道你用的多大的管子，多大的超声探头

Pierce

【在 s**********a 的大作中提到】

: 谢谢这位兄弟这么详细的回答。
: 1，我打算用不同的片段再试试。同时打算试试 in vitro expression system。Pierce
: 有这样的KIT，不知效果怎么样。
: 2，超声的时候确实在冰水里超的，3次，每次15s，间隔15s。确实挺奇怪的。大家都是
: 怎么去除粘稠这个问题的？
: 谢谢！
:
: down
: tag

M*02013-02-26 08:02

10 楼

周杰伦这组只能用平庸来形容，没有一首歌有听第二遍的欲望，还不如盲选时精彩，可
惜了这些好学员，

s*e2013-02-26 08:02

11 楼

超声15秒的duty cycle是多少，建议不要超过50%，输出最好低于20%。
粘稠大多由于DNA，超声确实比DNAase效果好一些。但是你要是离心能除去粘稠物的话
，倒不至于太追求破碎DNA了。另外，把Mg离子加到2mM也有助于DNAase作用。
in vitro表达优化起来可能要花点时间，除非你自己经常做或者实验室里有老手，否则
在没到山穷水尽的情况下不推荐使用。

Pierce

【在 s**********a 的大作中提到】

d*32013-02-26 08:02

12 楼

包包给人一种感动，曾给人的感觉是技巧好，但不太能引起共鸣

s*a2013-02-26 08:02

13 楼

我觉得超声次数已经足够，因为超声后不再粘稠。问题是超声后我的蛋白变没了，不知
为什么。

【在 d****h 的大作中提到】

: 没做过这么大的蛋白
: 不过感觉你超的次数太少，还有超的时候，要确保管子没有热，如果热间隔时间要长一
: 些。
: 不知道你用的多大的管子，多大的超声探头
:
: Pierce

l*y2013-02-26 08:02

14 楼

都在炫技，花里胡哨的

【在 w**a 的大作中提到】

s*a2013-02-26 08:02

15 楼

再次感谢您的建议！
现在的速度（14000转，18000g）只能沉淀少量的碎片，上清还是粘稠的。其实粘稠也
无所谓，就怕影响蛋白跟柱子的结合。因为我过了一遍柱子（Pierce 的 His pull
down kit），做western检测不到蛋白，过柱前能检测到。
in vitro expression 我没做过，实验室更没老手。前两天Pierce 的销售来我们实验
室的时候推荐的。经你这么一说，我还真不敢试了。怕耽误时间啊。
我现在发现了，太多的实验都没原来想的那么简单。刚开始可能觉得一两个星期就能做
完，真做起来可能两三个月都完成不了，总有这样那样的问题。

【在 s*******e 的大作中提到】

: 超声15秒的duty cycle是多少，建议不要超过50%，输出最好低于20%。
: 粘稠大多由于DNA，超声确实比DNAase效果好一些。但是你要是离心能除去粘稠物的话
: ，倒不至于太追求破碎DNA了。另外，把Mg离子加到2mM也有助于DNAase作用。
: in vitro表达优化起来可能要花点时间，除非你自己经常做或者实验室里有老手，否则
: 在没到山穷水尽的情况下不推荐使用。
:
: Pierce