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请教低浓度蛋白的His-tag purification

请教低浓度蛋白的His-tag purification# Biology - 生物学

c*e2013-03-13 07:03

1 楼

估计这儿有人·明白：有个PBO盒子，装了硬盘，通过SMB传递文件，现在想查看里面硬
盘空间，不想打开连电脑看，有没有办法查看remotely？

s*a2013-03-13 07:03

2 楼

His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？

a*o2013-03-13 07:03

3 楼

不连电脑你用什么看？remote到哪个设备上看？微波炉？

【在 c*******e 的大作中提到】

: 估计这儿有人·明白：有个PBO盒子，装了硬盘，通过SMB传递文件，现在想查看里面硬
: 盘空间，不想打开连电脑看，有没有办法查看remotely？

b*n2013-03-13 07:03

4 楼

可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看

【在 s*****a 的大作中提到】

: His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
: purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
: 是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
: Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
: cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
: uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
: resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
: 是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？

j*r2013-03-13 07:03

5 楼

ssh到pbo, df -h, or fdisk

【在 a*o 的大作中提到】

: 不连电脑你用什么看？remote到哪个设备上看？微波炉？

m*82013-03-13 07:03

6 楼

不做IP能用Ni-NTA拉下来吗？

【在 s*****a 的大作中提到】

a*o2013-03-13 07:03

7 楼

你拿什么ssh？不开电脑你能ssh？

【在 j*******r 的大作中提到】

: ssh到pbo, df -h, or fdisk

s*a2013-03-13 07:03

8 楼

忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
10mM Tris, pH7.8做binding.
我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊

【在 b******n 的大作中提到】

: 可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
: 如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
: 需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看

e*i2013-03-13 07:03

9 楼

cell phone or pad, haha

【在 a*o 的大作中提到】

: 你拿什么ssh？不开电脑你能ssh？

s*a2013-03-13 07:03

10 楼

还没做过这个control。但是不做IP背景会不会太多，导致更难bind?

【在 m*******8 的大作中提到】

:
: 不做IP能用Ni-NTA拉下来吗？

c*e2013-03-13 07:03

11 楼

让你见笑，我的意思是，如何在内网用电脑查看。

【在 a*o 的大作中提到】

: 不连电脑你用什么看？remote到哪个设备上看？微波炉？

m*82013-03-13 07:03

12 楼

Milliopore
你IP之后用SDS洗脱，会把antibody一起洗下来，这样继续和你的蛋白结合，掩盖
了his tag，这个解释合理否？

【在 s*****a 的大作中提到】

: 忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
: 10mM Tris, pH7.8做binding.
: 我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
: 把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
: 还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
: Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
: SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊

c*e2013-03-13 07:03

13 楼

我用个lunix laptop，是不是可用这个试试？

【在 j*******r 的大作中提到】

: ssh到pbo, df -h, or fdisk

y*y2013-03-13 07:03

14 楼

要做的完全一样啊
我现在没用IP直接用Ni纯化之后杂带超多所以打算加一个IP
IP之后准备直接用6Mguanidine洗脱不知道可行性怎么样

y*y2013-03-13 07:03

15 楼

Urea了应该不会再结合了
据说tris会影响Ni结合
再有尿素时间长了pH会变化最好新配

【在 m*******8 的大作中提到】

:
: Milliopore
: 你IP之后用SDS洗脱，会把antibody一起洗下来，这样继续和你的蛋白结合，掩盖
: 了his tag，这个解释合理否？

m*82013-03-13 07:03

16 楼

有些结合比较强的即使在UREA的环境中还是有结合的，所以最好在IP之前用Ni拉一下，
看到底是his tag本身的问题，还是IP之后的问题。

【在 y****y 的大作中提到】

: Urea了应该不会再结合了
: 据说tris会影响Ni结合
: 再有尿素时间长了pH会变化最好新配

p*y2013-03-13 07:03

17 楼

why use phosphate buffer for His-tag, it will precipitate Ni2+ and your
beads won't bind your His-tag protein anymore

b*n2013-03-13 07:03

18 楼

我们总是用phophate buffer纯化his-tag
没啥问题
phosphate buffer的pH随温度变化没有tris大，也就是pH更稳定

【在 p****y 的大作中提到】

: why use phosphate buffer for His-tag, it will precipitate Ni2+ and your
: beads won't bind your His-tag protein anymore

b*n2013-03-13 07:03

19 楼

你把跟Ni2+ bead结合之后wash的条件也写出来看看

Milliopore

【在 s*****a 的大作中提到】

m*82013-03-13 07:03

20 楼

你蛋白的最后用途是什么？

【在 y****y 的大作中提到】

: 要做的完全一样啊
: 我现在没用IP直接用Ni纯化之后杂带超多所以打算加一个IP
: IP之后准备直接用6Mguanidine洗脱不知道可行性怎么样

k*l2013-03-13 07:03

21 楼

有可能你的蛋白 his-tag 已经被降解掉了
可以做Western看看，但是要注意千分之一的蛋白有tag，western也会有信号，所以要
和另一个 his-tag 蛋白比较一下强度

threshold?
bead)？

【在 s*****a 的大作中提到】

y*y2013-03-13 07:03

22 楼

mass

【在 m*******8 的大作中提到】

:
: 你蛋白的最后用途是什么？

a*n2013-03-13 07:03

23 楼

低浓度蛋白的His纯化之前用IP(antibody)浓缩? 在本身就很杂的细胞extract中增加蛋
白不是好的开始,比较routine的办法用离子交换树脂(Ion exchange)浓缩后脱盐再过
His柱,根据结果再继续纯化.前面的步骤不要加任何SDS,SDS不可能靠脱盐就能洗脱的,
会严重干扰后续纯化,最后也很难复性.

m*82013-03-13 07:03

24 楼

看样子LZ是想找相互作用蛋白，不是想得到纯的蛋白。

【在 a****n 的大作中提到】

: 低浓度蛋白的His纯化之前用IP(antibody)浓缩? 在本身就很杂的细胞extract中增加蛋
: 白不是好的开始,比较routine的办法用离子交换树脂(Ion exchange)浓缩后脱盐再过
: His柱,根据结果再继续纯化.前面的步骤不要加任何SDS,SDS不可能靠脱盐就能洗脱的,
: 会严重干扰后续纯化,最后也很难复性.