o*n
2 楼
这两段DNA编码的蛋白有一个残基的区别,假设它们叫A和B。我要在同一种细菌里表达A
或者B,然后把表达A或者B的细菌混合在一起长,最后我需要想办法区分表达A和B的DNA
,也就是这两段只有一个碱基不同的DNA。
我查过,能切其中一种DNA的内切酶有两种没得卖,有一种切的位点太多。我刚刚想到
能否
PCR个很短的片段出来,避开这种酶其它的位点,不过我还不知道很短的PCR好不好做。
我得满足以下条件:
1. 我不能加tag,因为之前的实验没有加tag;
2. 我不能拿去next-gen sequencing;
3. 我们是分子实验室,没有跑蛋白胶的器材;
4. 补充下,还得能至少半定量,就是能看出来两段DNA的大致比例。
我知道DGGE/TGGE可以,但要跑胶;我找到这篇文章,http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0055154,好像更麻烦。wiki的页面上提到鉴定SNP用的办法好像都要跑胶或者做质谱。
还有什么办法吗?
或者B,然后把表达A或者B的细菌混合在一起长,最后我需要想办法区分表达A和B的DNA
,也就是这两段只有一个碱基不同的DNA。
我查过,能切其中一种DNA的内切酶有两种没得卖,有一种切的位点太多。我刚刚想到
能否
PCR个很短的片段出来,避开这种酶其它的位点,不过我还不知道很短的PCR好不好做。
我得满足以下条件:
1. 我不能加tag,因为之前的实验没有加tag;
2. 我不能拿去next-gen sequencing;
3. 我们是分子实验室,没有跑蛋白胶的器材;
4. 补充下,还得能至少半定量,就是能看出来两段DNA的大致比例。
我知道DGGE/TGGE可以,但要跑胶;我找到这篇文章,http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0055154,好像更麻烦。wiki的页面上提到鉴定SNP用的办法好像都要跑胶或者做质谱。
还有什么办法吗?
d*p
4 楼
design primers with the different bases at the end of 3'
X*n
6 楼
TaqMan® Allelic Discrimination assay
s*s
8 楼
没仔细看。是不是有个氨基酸分别,要用DNA简单的判断?
你再做一个好切的同义突变放在蛋白的其他位置上不就行了
达A
DNA
【在 o******n 的大作中提到】
: 这两段DNA编码的蛋白有一个残基的区别,假设它们叫A和B。我要在同一种细菌里表达A
: 或者B,然后把表达A或者B的细菌混合在一起长,最后我需要想办法区分表达A和B的DNA
: ,也就是这两段只有一个碱基不同的DNA。
: 我查过,能切其中一种DNA的内切酶有两种没得卖,有一种切的位点太多。我刚刚想到
: 能否
: PCR个很短的片段出来,避开这种酶其它的位点,不过我还不知道很短的PCR好不好做。
: 我得满足以下条件:
: 1. 我不能加tag,因为之前的实验没有加tag;
: 2. 我不能拿去next-gen sequencing;
: 3. 我们是分子实验室,没有跑蛋白胶的器材;
你再做一个好切的同义突变放在蛋白的其他位置上不就行了
达A
DNA
【在 o******n 的大作中提到】
: 这两段DNA编码的蛋白有一个残基的区别,假设它们叫A和B。我要在同一种细菌里表达A
: 或者B,然后把表达A或者B的细菌混合在一起长,最后我需要想办法区分表达A和B的DNA
: ,也就是这两段只有一个碱基不同的DNA。
: 我查过,能切其中一种DNA的内切酶有两种没得卖,有一种切的位点太多。我刚刚想到
: 能否
: PCR个很短的片段出来,避开这种酶其它的位点,不过我还不知道很短的PCR好不好做。
: 我得满足以下条件:
: 1. 我不能加tag,因为之前的实验没有加tag;
: 2. 我不能拿去next-gen sequencing;
: 3. 我们是分子实验室,没有跑蛋白胶的器材;
a*t
9 楼
boost的6s 16gb版本算下来400多刀
o*n
12 楼
谢谢各位的回复。
二三楼的回答好像是一个意思。那个kit看起来很好,正合我的要求。:)
四楼的回复也给了我启发。其实我之前做了另两个DNA,用酶切分开的它们。这次的两
个本想尽量保持方法一致,无奈没合适的酶。我不想改变蛋白,因为可能影响功能,但
你说的办法,可以在细菌生长结束后,扩增这两种DNA的时候加进去,应该只多了一步
而已。如果我没理解错,加入这个新的位点,是在引物里加,引物和其中一种DNA
specifically结合,另一种DNA因为错了个碱基,就不能被扩增,所以酶切可以区分开
它们。这样估计annealing温度要好高吧,然后有点不好(半)定量。
二三楼的回答好像是一个意思。那个kit看起来很好,正合我的要求。:)
四楼的回复也给了我启发。其实我之前做了另两个DNA,用酶切分开的它们。这次的两
个本想尽量保持方法一致,无奈没合适的酶。我不想改变蛋白,因为可能影响功能,但
你说的办法,可以在细菌生长结束后,扩增这两种DNA的时候加进去,应该只多了一步
而已。如果我没理解错,加入这个新的位点,是在引物里加,引物和其中一种DNA
specifically结合,另一种DNA因为错了个碱基,就不能被扩增,所以酶切可以区分开
它们。这样估计annealing温度要好高吧,然后有点不好(半)定量。
g*a
13 楼
有单买手机的DEAL吗?
谢谢!
谢谢!
c*g
14 楼
你可以用两个DNA共同区域的引物扩增包含这个polymorphism的片段。
然后Sanger sequence这个PCR产物(实际上是个mixture),看两个碱基的峰的比值。
你可以做个标准曲线,用梯度的已知比例的DNA。然后你就可以估计这里面两个allele
的比例了。
【在 o******n 的大作中提到】
: 谢谢各位的回复。
: 二三楼的回答好像是一个意思。那个kit看起来很好,正合我的要求。:)
: 四楼的回复也给了我启发。其实我之前做了另两个DNA,用酶切分开的它们。这次的两
: 个本想尽量保持方法一致,无奈没合适的酶。我不想改变蛋白,因为可能影响功能,但
: 你说的办法,可以在细菌生长结束后,扩增这两种DNA的时候加进去,应该只多了一步
: 而已。如果我没理解错,加入这个新的位点,是在引物里加,引物和其中一种DNA
: specifically结合,另一种DNA因为错了个碱基,就不能被扩增,所以酶切可以区分开
: 它们。这样估计annealing温度要好高吧,然后有点不好(半)定量。
然后Sanger sequence这个PCR产物(实际上是个mixture),看两个碱基的峰的比值。
你可以做个标准曲线,用梯度的已知比例的DNA。然后你就可以估计这里面两个allele
的比例了。
【在 o******n 的大作中提到】
: 谢谢各位的回复。
: 二三楼的回答好像是一个意思。那个kit看起来很好,正合我的要求。:)
: 四楼的回复也给了我启发。其实我之前做了另两个DNA,用酶切分开的它们。这次的两
: 个本想尽量保持方法一致,无奈没合适的酶。我不想改变蛋白,因为可能影响功能,但
: 你说的办法,可以在细菌生长结束后,扩增这两种DNA的时候加进去,应该只多了一步
: 而已。如果我没理解错,加入这个新的位点,是在引物里加,引物和其中一种DNA
: specifically结合,另一种DNA因为错了个碱基,就不能被扩增,所以酶切可以区分开
: 它们。这样估计annealing温度要好高吧,然后有点不好(半)定量。
g*a
15 楼
有单买手机的DEAL吗?
谢谢!
谢谢!
J*9
19 楼
可以试一试设计dCAPS:
http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html
http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html
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