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求助：如何回答审稿人关于纯化获得可溶、膜蛋白的意外收获？

求助：如何回答审稿人关于纯化获得可溶、膜蛋白的意外收获？# Biology - 生物学

l*u2013-09-05 07:09

1 楼

近日，一位名叫袁茵茵的女演员在微博实名爆料，说北影副教授向能对自己偏色色骗炮
，说了很多，还喊话这个男的老婆，不过这男教授没有回应，这个妻子也没有回应，北
影也没有回应，所以这变成冷处理了。
估计也是这学校后台硬，所以没有起什么风浪。
这个演员，没什么名气，我其实是第一次知道这个人，但是从这个事情爆出来看，这应
该是真的，只是因为这女的不出名，男的也没出名，所以吃瓜群众都比较什么说，没什
么热情。其实这是很恐怖的事情，因为这说明，公众对于娱乐圈，觉得这种事情太正常
了。所以这反而显得娱乐圈不正常。这么想是不是可悲。甚至有人说，这娱乐圈就没什
么好人，好吧，除了王宝强，因为王宝强是自己的老婆和经纪人一起都没搞到他的黑材
料。那是真的没黑材料。

e*r2013-09-05 07:09

2 楼

我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。

m*u2013-09-05 07:09

3 楼

这种事情太多了，娱乐圈太乱了

s*e2013-09-05 07:09

4 楼

估计人家想问的是怎么不用detergent就纯化到了膜蛋白，潜台词是你怎么保证膜蛋白
在无detergent体系中保留了正常功能和天然构象。

M*n2013-09-05 07:09

5 楼

这个女的是自己的问题，真的是这样的

q*g2013-09-05 07:09

6 楼

是啊。我看到你说不用detergent，也觉得很奇怪啊。你只是说分子量正确，但可能构
象变了。

l*a2013-09-05 07:09

7 楼

这算不上新闻吧

i*l2013-09-05 07:09

8 楼

“不用Detergent，还是可溶的细菌膜蛋白”？
这会是每个人的都有疑问--为什么没有Detergent就能提纯？还有活性？
（你也没说怎么破碎的哪里表达的，Assuming是大肠，超声波。）
我估计，可能极少数穿莫蛋白和细胞膜在破碎过程中形成MICELLS，然后过柱子时候被你
拿到了。如果NTA柱子挂了蛋白后变成黄色，或者你的Elute是浅黄色，就很有可能是有
膜成分共同被结合，洗脱了。当然如果及少量，也可能看不到颜色变黄。
不怕麻烦的话，可以挑个简单的实验加温和的Detergent （OG，DM，等等温和但是CMC
大点儿的），看看结果是不是一样。
Pierce的手册里有很好的关于Detergent的介绍

【在 e********r 的大作中提到】

: 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
: pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
: 确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
: IPTG。
: 论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
: 我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
: 纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
: ，谢谢。

e*r2013-09-05 07:09

9 楼

这个完全有可能，我们的结合是黄色的。
您脚着这样拿到的是微小的膜颗粒还是蛋白？

被你
CMC

【在 i***l 的大作中提到】

: “不用Detergent，还是可溶的细菌膜蛋白”？
: 这会是每个人的都有疑问--为什么没有Detergent就能提纯？还有活性？
: （你也没说怎么破碎的哪里表达的，Assuming是大肠，超声波。）
: 我估计，可能极少数穿莫蛋白和细胞膜在破碎过程中形成MICELLS，然后过柱子时候被你
: 拿到了。如果NTA柱子挂了蛋白后变成黄色，或者你的Elute是浅黄色，就很有可能是有
: 膜成分共同被结合，洗脱了。当然如果及少量，也可能看不到颜色变黄。
: 不怕麻烦的话，可以挑个简单的实验加温和的Detergent （OG，DM，等等温和但是CMC
: 大点儿的），看看结果是不是一样。
: Pierce的手册里有很好的关于Detergent的介绍

q*g2013-09-05 07:09

10 楼

这个蛋白只有两个跨膜区，可能没有detergent对蛋白的活性影响不大。解释一下就可
以了吧

e*r2013-09-05 07:09

11 楼

我们昨天用它过了下0.22 um的滤膜，可以通过，表明不太像是和膜形成了小微囊

【在 q******g 的大作中提到】

: 这个蛋白只有两个跨膜区，可能没有detergent对蛋白的活性影响不大。解释一下就可
: 以了吧

s*e2013-09-05 07:09

12 楼

这个不太具有说服力，一个典型的7-10跨膜的蛋白分子的维度也就七八个纳米，即使结
合磷脂形成微囊也不一定会达到足以被220nm的膜截留的尺度。
我觉得可以考虑对你的蛋白洗脱液进行定磷，估算一下蛋白和磷脂的摩尔比率。
BTW，你跑电泳的时候会有一片弥散带在染料前沿附近吗？那个一般是磷脂或去垢剂。

【在 e********r 的大作中提到】

: 我们昨天用它过了下0.22 um的滤膜，可以通过，表明不太像是和膜形成了小微囊

q*g2013-09-05 07:09

13 楼

做MS时，是否能看到脂类的峰呢？或者有什么脂的标记物，可以证明你的蛋白是和
膜上的脂一起洗脱下来。或者找个文献，看看是否有人用类似的方法纯化出膜蛋白。

g*p2013-09-05 07:09

14 楼

你确信你的蛋白是膜蛋白？做过细胞定位么？
很多膜蛋白的猜测都取决于疏水区的预测
而疏水区有可能只是在折叠的时候位于蛋白核心而已，不见得真的是膜蛋白
你的结果不是意外不意外的问题
如果我看了这样的实验结果，直接会强烈质疑你文章的技术方法的可性度
从你对膜蛋白确证以及测活的方法学一定会要求你逐步讲个清楚
再没有合理解释之前，我完全无法信任你基于该蛋白的任何重要发现的claim

【在 e********r 的大作中提到】

e*r2013-09-05 07:09

15 楼

呵呵，有道理，但说得挺吓人。
这个蛋白因为是个激酶。随后检测的活性、特异性都非常好，倒肯定是对的。
另外，这一类蛋白如果提取inverted membrane vehicle也是有活性的。

【在 g*****p 的大作中提到】

: 你确信你的蛋白是膜蛋白？做过细胞定位么？
: 很多膜蛋白的猜测都取决于疏水区的预测
: 而疏水区有可能只是在折叠的时候位于蛋白核心而已，不见得真的是膜蛋白
: 你的结果不是意外不意外的问题
: 如果我看了这样的实验结果，直接会强烈质疑你文章的技术方法的可性度
: 从你对膜蛋白确证以及测活的方法学一定会要求你逐步讲个清楚
: 再没有合理解释之前，我完全无法信任你基于该蛋白的任何重要发现的claim

i*l2013-09-05 07:09

16 楼

nod 过滤膜没意义。
其实就先Argue一下好了，根据你说的“这一类蛋白如果提取inverted membrane
vehicle也是有活性的”，再加楼上那个建议
：”
发信人: qianwang (oasis), 信区: Biology
这个蛋白只有两个跨膜区，可能没有detergent对蛋白的活性影响不大。解释一下就可
以了吧“
///另外，如果真要弄清楚，不怕麻烦，还可以吧你的Elute做个冷冻电镜（或者负染？
）看看，如果是
Micelles 会看到一个一个的
小球的。不知道别的手段能不能区分，也许Light Scattering 的机器也能？不过这些
就要工作量了有时候看值得不值得。

【在 s*******e 的大作中提到】

: 这个不太具有说服力，一个典型的7-10跨膜的蛋白分子的维度也就七八个纳米，即使结
: 合磷脂形成微囊也不一定会达到足以被220nm的膜截留的尺度。
: 我觉得可以考虑对你的蛋白洗脱液进行定磷，估算一下蛋白和磷脂的摩尔比率。
: BTW，你跑电泳的时候会有一片弥散带在染料前沿附近吗？那个一般是磷脂或去垢剂。