做realtime PCR前，RNA要测浓度调正浓度吗？ - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

做realtime PCR前，RNA要测浓度调正浓度吗？

做realtime PCR前，RNA要测浓度调正浓度吗？# Biology - 生物学

c*k2014-01-20 08:01

1 楼

偶的前一份postdoc今天是最后一天。巧不巧今天收到第一个offer，不知道现在申请
H1b transfer来不来得及，还是等偶的EAD? EB1A 140是11月份批的，12月下旬才递的
485和EAD。
鄙视一下自己的懒惰先。当时因为搬家什么都赶在一起有点burn out的感觉。

S*g2014-01-20 08:01

2 楼

提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
谢谢

G*02014-01-20 08:01

3 楼

恭喜拿到offer，帮你顶一下

s*r2014-01-20 08:01

4 楼

你反转录的时候，难道不需要知道加了多少RNA吗？
太多的话，转录反应效率会不会受影响。

【在 S**********g 的大作中提到】

: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
: 做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
: 有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
: 是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
: 谢谢

G*02014-01-20 08:01

5 楼

恭喜拿到offer，帮你顶一下

S*g2014-01-20 08:01

6 楼

我对这个不是很懂所以才问，怎么样算是太多？会怎么样影响反转录效率，我一个师姐
告诉我的，提了RNA之后什么也别干快去反转录，不用测浓度因为realtime pcr时有内能

【在 s******r 的大作中提到】

: 你反转录的时候，难道不需要知道加了多少RNA吗？
: 太多的话，转录反应效率会不会受影响。

c*k2014-01-20 08:01

7 楼

谢谢！问了版主的意见，说都可以，所以现在就剩下等了。祝你的140顺利通过！

j*n2014-01-20 08:01

8 楼

内能
在一定范围内你师姐说的是对的尤其是每次提的细胞都差不多的时候基本可以不测
按照之前的protocol加就行了你师姐肯定是常做这种scale 心里有数
换一种情况如果两个样品一个RNA极端少一个极端多在同一个scale的反转中那个
极端多的样品很可能反转不完全导致最后结果与实际量比偏少量太少也可能会导致后
面的PCR反应被背景信号干扰导致假阳性结果比实际量偏多那肯定有就误差了呗

【在 S**********g 的大作中提到】

: 我对这个不是很懂所以才问，怎么样算是太多？会怎么样影响反转录效率，我一个师姐
: 告诉我的，提了RNA之后什么也别干快去反转录，不用测浓度因为realtime pcr时有内能

a*a2014-01-20 08:01

9 楼

做个realtime那么急急吼吼的干啥
抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性，主要是保证模板里面大片段不被破坏，以
后拉长基因，做文库好用
你一个realtime检测的是100多bp的东西，怕啥啦
师姐胸大不，不大就按我说的做去测浓度。
万一你没测浓度加了一样的体积去反转录，结果不幸有几个浓度太低反转效率不好，岂
不是要重新收集样品？

内能

【在 S**********g 的大作中提到】

w*a2014-01-20 08:01

10 楼

那要是师姐胸大呢？是不是就可以干脆不测了。。。

【在 a*******a 的大作中提到】

: 做个realtime那么急急吼吼的干啥
: 抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性，主要是保证模板里面大片段不被破坏，以
: 后拉长基因，做文库好用
: 你一个realtime检测的是100多bp的东西，怕啥啦
: 师姐胸大不，不大就按我说的做去测浓度。
: 万一你没测浓度加了一样的体积去反转录，结果不幸有几个浓度太低反转效率不好，岂
: 不是要重新收集样品？
:
: 内能

n*e2014-01-20 08:01

11 楼

这个问题我遇到过。RNA 到cDNA，不同的RNA 的浓度影响RT的效率，你可以做个
standard curve，用一系列浓度，包括你估计的RNA 药品的浓度（通过preliminary的
RT pcr测）如果你的样品差别不大，就没问题，如果你的样品浓度差别很大。有可能
浓度很低的样品，RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number，
基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA，但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
copy RNA 做RT，效率会很低，我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
所以也没问题。你用的是什么RTase， Superscript III 好一点，另外加点RNAase
inhibitor.
我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道，很多人都不这么做，直接拿内参。
。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的

【在 S**********g 的大作中提到】

a*72014-01-20 08:01

12 楼

我做的是测浓度，
按浓度加RNA到反转cDNA的体系里这样出来的cDNA浓度大约就是统一的
一般用Biorad的kit反转出来到1000ng/ul，我在N年前刚做PhD的时候还测过反转出的
cDNA浓度，比较一致的在1000~1100ng/ul之间，此后的N年里再也不测了，cDNA1:10稀
释后做PCR

【在 S**********g 的大作中提到】

d*i2014-01-20 08:01

13 楼

强烈建议你测一下RNA浓度。。。当年做一个实验老是做不出差异来，很郁闷，后来自
己一个人在那里琢磨，去测了一下浓度，然后调整成同一个浓度，重复了一下realtime
，做出了显著差异。被老板狠狠鄙视了一下，至今还不能忘记那时候老板的眼神。。。
。。。。

l*a2014-01-20 08:01

14 楼

现在都是粗放流？

【在 S**********g 的大作中提到】

A*y2014-01-20 08:01

15 楼

A lot of people do rt-PCR badly. Let's not even talk about how many non-
linear primer in the published articles. Personally, if you are doing
relative C(t), I would always normalize my RNA/cDNA concentration just to
make sure my housekeeping gene is not moving!!!

i*l2014-01-20 08:01

16 楼

同意上面几位有具体内容的意见，补充2点，
1. 大多数的实验是要比较不同Sample中的目的基因，所以应该把各个Sample的总RNA量
调成差不多的量
2. 每个RT Kit都会对Input RNA的量有个范围规定，比如我记得Invitrogen的
SuperScript3就是2-10Ug的总RNA吧，你当然不能超出这个范围。

o*n2014-01-20 08:01

17 楼

我记得我做的时候是调的。dahuzi那个回复太搞笑了。

S*g2014-01-20 08:01

18 楼

我们用的是SYBR，下次我还是测浓度吧，谢谢

7

【在 n********e 的大作中提到】

: 这个问题我遇到过。RNA 到cDNA，不同的RNA 的浓度影响RT的效率，你可以做个
: standard curve，用一系列浓度，包括你估计的RNA 药品的浓度（通过preliminary的
: RT pcr测）如果你的样品差别不大，就没问题，如果你的样品浓度差别很大。有可能
: 浓度很低的样品，RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number，
: 基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA，但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
: copy RNA 做RT，效率会很低，我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
: 所以也没问题。你用的是什么RTase， Superscript III 好一点，另外加点RNAase
: inhibitor.
: 我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道，很多人都不这么做，直接拿内参。
: 。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的

S*g2014-01-20 08:01

19 楼

感谢楼上几位朋友的解答，我学到了很多东西

s*e2014-01-20 08:01

20 楼

我做得时候是调的。如果你做得样品浓度一直比较稳定，cDNA都能出来，那么时间长了
也可以省略（虽然我个人不推荐）。我那时候不光测RNA浓度调成一致，还要跑个快胶
看看提出来了没有。迅速的做rtPCR有时候是怕RNA降解。