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急求，如何用Western blot confirm pull down effeciency of crosslinked samples

急求，如何用Western blot confirm pull down effeciency of crosslinked samples# Biology - 生物学

m*52014-04-29 07:04

1 楼

小弟现在正在做Chip
所用抗体IP effeciency尚可
目前打算用此抗体做Chip,不过问题来了，sample crosslink, lysis，以及dilute后
用Beads-antibody pulldown，之后用protein loading buffer煮30分钟后上SDS-page.
跑SDS-page后目的带附近什么也没有。同一块胶的阳性对照也正常
input目的带也没有跑出来
请问有同学遇到过这种问题么？
补充说明一下，Chip所用材料是invivo knock in了一个tag的老鼠的组织。

n*w2014-04-29 07:04

2 楼

Did you load the entire volume or you just load a portion? I can't say for
Chip but when I did regular IP I used a small volume and loaded all onto the
gels and this would tell me how efficient my IP works.

m*52014-04-29 07:04

3 楼

right now my problem seems to not be about ip but rather westernblot on
cross linked sample . my input did not work as well.

【在 n***w 的大作中提到】

: Did you load the entire volume or you just load a portion? I can't say for
: Chip but when I did regular IP I used a small volume and loaded all onto the
: gels and this would tell me how efficient my IP works.

g*32014-04-29 07:04

4 楼

It seems you have trouble in reverse-crosslinking step. show us your recipe
for reverse crosslinking. Run a gel on dna.

m*52014-04-29 07:04

5 楼

Thank you!
I did not go through the reverse crosslinking step for Chip-qPCR
What I did is I washed the dynal-beads by Ip buffer and boiled for 15 mins
in invitrogen LDS protein loading buffer.

recipe

【在 g*********3 的大作中提到】

: It seems you have trouble in reverse-crosslinking step. show us your recipe
: for reverse crosslinking. Run a gel on dna.

m*52014-04-29 07:04

6 楼

自己顶一下

d*72014-04-29 07:04

7 楼

我刚做ChIP的时候也遇到过这种情况，这种现象可能是factor specific
这样吧，你在跑ChIP的时候，再多跑一下两个样品：
(1) un-crosslinked whole cell extract
(2) crosslinked but un-sonicated chromatin
如果(1)都没有目的条带，证明抗体根本不识别蛋白，或者蛋白根本不表达。但是既然
你说是knockin tag，也许表达亮太低
如果(1)有带，(2)没有，说明蛋白的epitope可能被formadehyde毁掉了
如果(1) (2)都有带，超声后的input没有带，证明oversonication，把蛋白给毁了，我
最近就遇到这种情况，都是input，超声前能检测到带，超声后就没了。。。。
还有，煮10分钟足以，30分钟有点过

f*u2014-04-29 07:04

8 楼

有点不明白你说的(2)。这个直接去跑的话那不是等于在跑完整的chromatin，这么大一
团东西怎么跑？

【在 d****7 的大作中提到】

: 我刚做ChIP的时候也遇到过这种情况，这种现象可能是factor specific
: 这样吧，你在跑ChIP的时候，再多跑一下两个样品：
: (1) un-crosslinked whole cell extract
: (2) crosslinked but un-sonicated chromatin
: 如果(1)都没有目的条带，证明抗体根本不识别蛋白，或者蛋白根本不表达。但是既然
: 你说是knockin tag，也许表达亮太低
: 如果(1)有带，(2)没有，说明蛋白的epitope可能被formadehyde毁掉了
: 如果(1) (2)都有带，超声后的input没有带，证明oversonication，把蛋白给毁了，我
: 最近就遇到这种情况，都是input，超声前能检测到带，超声后就没了。。。。
: 还有，煮10分钟足以，30分钟有点过

d*72014-04-29 07:04

9 楼

对，完整的chromatin是一大坨，但是加了sample buffer，煮了之后，就不是了
跑起来没问题

【在 f**u 的大作中提到】

: 有点不明白你说的(2)。这个直接去跑的话那不是等于在跑完整的chromatin，这么大一
: 团东西怎么跑？

m*52014-04-29 07:04

10 楼

非常感谢！！！另外很不好意思这么迟才回复。
这也就是说westernblot crosslinked sample是个routine的手段来检测抗体是否work
for Chip了？
为什么常见的protocol都只要求Co-IP verify antibody呢？

【在 d****7 的大作中提到】

: 对，完整的chromatin是一大坨，但是加了sample buffer，煮了之后，就不是了
: 跑起来没问题