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[求建议] CRISPR 不work 的可能原因
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[求建议] CRISPR 不work 的可能原因# Biology - 生物学
C*n
1
看到很多大虾在谈论CRISPR,屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统,非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination,so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works,在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot,因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端,NLS 在Cas9的N末端,
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter,是个问题,由于该物种中U6 没有define,PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议,用了Pol II,一个version是直接用Pol II, 另一个
version是加了Ribozyme structure。此外还直接用过in vitro transcribed 的gRNA.
3)用NEB 的commercial Cas9 验证过gRNA的activity。
4)本物种的转化效率不高,转化方法用的是protoplasts-PEG。
试了3回转化,利用PCR-Restrict enzyme cleavage的方法screen,但是没有得到
Mutant。
理论上来说,CRISPR 是很 straightforward的,就两个components, 请问各位大虾,
如果拿不到mutantd话,可能的原因是什么?Target?Or screening strategy? 十分
感谢!
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m*2
2
我现在也遇到同样类似的问题,在one vectorv系统,即是sgRNA和cas9在同一个在题里
面表达,我得到的病毒的titer很低,试了各种方法,包括浓缩病毒,titer还是很低。
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s*r
3
只能分开做两个病毒,one vector系统就是titer低目前无解

【在 m********2 的大作中提到】
: 我现在也遇到同样类似的问题,在one vectorv系统,即是sgRNA和cas9在同一个在题里
: 面表达,我得到的病毒的titer很低,试了各种方法,包括浓缩病毒,titer还是很低。

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m*D
4
没作过真菌,所以,主意不一定合适。
你三次转化,效率不高,到你挑克隆,这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗?或带
resistance的基因?
从biotechniques的文章(Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
。。。。)来看,一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多(80%),也
就是没有indels发生。所以,他们用的是两个guide sequences(我也是这么干的),
直接切掉一段DNA。
另外,你要knockout的基因重要吗?会不会knockout后就不长了?
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j*i
5
记得bacteria里边NHEJ效率低而HR效率却非常高

replacement

【在 m*********D 的大作中提到】
: 没作过真菌,所以,主意不一定合适。
: 你三次转化,效率不高,到你挑克隆,这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗?或带
: resistance的基因?
: 从biotechniques的文章(Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
: 。。。。)来看,一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多(80%),也
: 就是没有indels发生。所以,他们用的是两个guide sequences(我也是这么干的),
: 直接切掉一段DNA。
: 另外,你要knockout的基因重要吗?会不会knockout后就不长了?

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C*n
6
谢谢,是的,至少是TALEN也试过了,不work either.
打算mutate的基因不是一个essential的基因。
目前的strategy是based on transient expression.我的载体是带resistance maker的
,如果你熟悉Arabidopsis mesophyll protoplasts transfection 的话,目前就做完
转化后,add antibiotics to enrich positive transformants 然后就直接PCR-RE
cleavage.
另外您提供的这篇paper 很有意思. 谢谢。

replacement

【在 m*********D 的大作中提到】
: 没作过真菌,所以,主意不一定合适。
: 你三次转化,效率不高,到你挑克隆,这中间有没有筛选--GFP可以用来筛选吗?或带
: resistance的基因?
: 从biotechniques的文章(Zheng,Q.et al, Precise gene deletion and replacement
: 。。。。)来看,一个guide sequence产生的DBS好像之是直接连回去的多(80%),也
: 就是没有indels发生。所以,他们用的是两个guide sequences(我也是这么干的),
: 直接切掉一段DNA。
: 另外,你要knockout的基因重要吗?会不会knockout后就不长了?

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m*2
7
lentiCRISPRv2 据说滴度很高,不知道如何?

【在 s******r 的大作中提到】
: 只能分开做两个病毒,one vector系统就是titer低目前无解
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m*a
8

is

【在 C****n 的大作中提到】
: 看到很多大虾在谈论CRISPR,屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
: 没有什么好的建议。
: background:
: 想在一个fungus里用CRISPR系统,非model system。
: 在该fungus中还没发现homologous recombination,so till now gene-knock-out is
: not accessible.
: current status:
: 1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
: 2)NLS works,在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
: NLS。 没有做western blot,因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端,NLS 在Cas9的N末端,

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m*D
9
我的问题不一样:为啥要用virus delivery system呢?转化(transfection)效率低的
话,cell sorting或Puro selection不是可以解决吗?
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题,transfection后不能等太长。而cas9是permanent deletion,又不
能保证transfected cells一定有genome editing发生,这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章,一个library是针对18000个基因,另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal transduction cascade。老板说主意不错,得有钱
啊。:)。不知道这两个library是不是可以买或者借来用。不过,这不用自己建吧。
恕我愚钝。谢指教!
(本来跟另一个帖子的,等我打完字,好像删了。就搁这里吧。)

【在 m********2 的大作中提到】
: lentiCRISPRv2 据说滴度很高,不知道如何?
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j*i
10
确实很高,虽然比一般的lenti有梯度降低,但非常好用。

【在 m********2 的大作中提到】
: lentiCRISPRv2 据说滴度很高,不知道如何?
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m*2
11
我将puro换成了GFP,结果不好用了。病毒包装的时候GFP能达到90%,但是病毒不能感
染任何细胞.

【在 j******i 的大作中提到】
: 确实很高,虽然比一般的lenti有梯度降低,但非常好用。
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a*i
12
你说的不work是得不到transformants还是可以得到但是都是假阳性?

is

【在 C****n 的大作中提到】
: 看到很多大虾在谈论CRISPR,屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
: 没有什么好的建议。
: background:
: 想在一个fungus里用CRISPR系统,非model system。
: 在该fungus中还没发现homologous recombination,so till now gene-knock-out is
: not accessible.
: current status:
: 1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
: 2)NLS works,在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
: NLS。 没有做western blot,因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端,NLS 在Cas9的N末端,

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j*i
13
有这种事?ca9-gfp已经有发过了啊。。。应该可行的 还有一种可能是 有的病毒是三
代有的是二代 包装质粒不一样

【在 m********2 的大作中提到】
: 我将puro换成了GFP,结果不好用了。病毒包装的时候GFP能达到90%,但是病毒不能感
: 染任何细胞.

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C*n
14
基于resistance marker 得到转化子,也就是说CRISPR 两个 components 在里面,但
是target没有突变。

【在 a*****i 的大作中提到】
: 你说的不work是得不到transformants还是可以得到但是都是假阳性?
:
: is

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a*i
15
我是做fungi的,但是是酿酒酵母,HR活性很强所以非常好用。我听朋友说他们一直想
在pichia里用cas9,但是一直不work,应该就是HR不够造成的。问个问题,你这个菌的
NHEJ activity怎么样?

【在 C****n 的大作中提到】
: 基于resistance marker 得到转化子,也就是说CRISPR 两个 components 在里面,但
: 是target没有突变。

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a*i
16
此外补充一点个人经验之谈:gRNA的expression level是整个系统效率高低的关键。在
单倍体的情况下还不是很明显,但是多倍体里非常明显。

【在 C****n 的大作中提到】
: 基于resistance marker 得到转化子,也就是说CRISPR 两个 components 在里面,但
: 是target没有突变。

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m*2
17
谢谢答复
是在lentiCRISPR V2的基础上将puro更换为GFP吗?
能告诉我是那篇文章吗?
谢谢

【在 j******i 的大作中提到】
: 有这种事?ca9-gfp已经有发过了啊。。。应该可行的 还有一种可能是 有的病毒是三
: 代有的是二代 包装质粒不一样

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j*i
18
v2上直接改的好像没有。类似的,Zhang Feng有一篇发cell上的lentiCRISPR-EGFP, 只
不过gRNA不在同一个载体里边。14年, NBT上有一篇做老鼠模型的,cas9-gfp-gRNA全在
一个lenti载体上。

【在 m********2 的大作中提到】
: 谢谢答复
: 是在lentiCRISPR V2的基础上将puro更换为GFP吗?
: 能告诉我是那篇文章吗?
: 谢谢

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C*n
19
这方面没有系统的研究,但是circular载体转化以后,大部分是整合在genome 的
transposon 里,所以应该是NHEJ率很高,对吧?

【在 a*****i 的大作中提到】
: 我是做fungi的,但是是酿酒酵母,HR活性很强所以非常好用。我听朋友说他们一直想
: 在pichia里用cas9,但是一直不work,应该就是HR不够造成的。问个问题,你这个菌的
: NHEJ activity怎么样?

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C*n
20
谢谢,我们这个是Diploid.
你说的问题这个也是我所纠结的地方,因为没法采用一个 well-established的系统,
比如U6 promoter。

【在 a*****i 的大作中提到】
: 此外补充一点个人经验之谈:gRNA的expression level是整个系统效率高低的关键。在
: 单倍体的情况下还不是很明显,但是多倍体里非常明显。

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j*n
21
难道是Yarrowia?
nhej效率非常高 我同学试着加nhej抑制剂 看看能不能提高效率
你也可以试试
[在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到:]
:这方面没有系统的研究,但是circular载体转化以后,大部分是整合在genome 的
:transposon 里,所以应该是NHEJ率很高,对吧?
:...........
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h*r
22
有人表达ligase 4
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a*i
23
Diploid应该还好了。不过我们用的不是U6 promoter,是SNR52的。也许你可以做个
rtpcr看下gRNA的表达?

【在 C****n 的大作中提到】
: 谢谢,我们这个是Diploid.
: 你说的问题这个也是我所纠结的地方,因为没法采用一个 well-established的系统,
: 比如U6 promoter。

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C*n
24
谢谢这个信息。
其实我倒是希望想按照通常大家做的,先拿到NHEJ 的mutant,然后倒入donor DNA,然
后再HR。因为直接Gene-knock-out已经try了decades了。

【在 j****n 的大作中提到】
: 难道是Yarrowia?
: nhej效率非常高 我同学试着加nhej抑制剂 看看能不能提高效率
: 你也可以试试
: [在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到:]
: :这方面没有系统的研究,但是circular载体转化以后,大部分是整合在genome 的
: :transposon 里,所以应该是NHEJ率很高,对吧?
: :...........

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C*n
25
情况是这样的。当然在我们这个物种里,我找到了U6(100多个copy,这个就很诡异),
然后Northern blot也是有signal的,但是克隆后的promoter不work。所以我现在是基
本上give up pol III了。

【在 a*****i 的大作中提到】
: Diploid应该还好了。不过我们用的不是U6 promoter,是SNR52的。也许你可以做个
: rtpcr看下gRNA的表达?

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