[求建议] CRISPR 不work 的可能原因# Biology - 生物学
C*n
1 楼
看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接用Pol II, 另一个
version是加了Ribozyme structure。此外还直接用过in vitro transcribed 的gRNA.
3)用NEB 的commercial Cas9 验证过gRNA的activity。
4)本物种的转化效率不高，转化方法用的是protoplasts-PEG。
试了3回转化，利用PCR-Restrict enzyme cleavage的方法screen，但是没有得到
Mutant。
理论上来说，CRISPR 是很 straightforward的，就两个components, 请问各位大虾，
如果拿不到mutantd话，可能的原因是什么？Target？Or screening strategy? 十分
感谢！
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接用Pol II, 另一个
version是加了Ribozyme structure。此外还直接用过in vitro transcribed 的gRNA.
3)用NEB 的commercial Cas9 验证过gRNA的activity。
4)本物种的转化效率不高，转化方法用的是protoplasts-PEG。
试了3回转化，利用PCR-Restrict enzyme cleavage的方法screen，但是没有得到
Mutant。
理论上来说，CRISPR 是很 straightforward的，就两个components, 请问各位大虾，
如果拿不到mutantd话，可能的原因是什么？Target？Or screening strategy? 十分
感谢！
