说说单细胞表观遗传学 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

说说单细胞表观遗传学

说说单细胞表观遗传学# Biology - 生物学

j*g2016-09-17 07:09

1 楼

想听听各位大神们的高见。
单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
不需要什么高超的实验技巧。
这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的
结论。缺点是不能定量、高通量。

s*y2016-09-17 07:09

2 楼

paper链接发来瞧瞧
你说的这个方法，可能对研究单个的、受转录调控的重要基因是很有用的（比如
p16INK4a locus）。
但是专门做表观遗传的实验室必定不会研究单个基因的调控，如果他们想讲个故事，说
某某修饰或者某某表观遗传的蛋白是重要的，必然需要一个全基因组水平的分析。至于
得出结论之后，再挑几个区域验证下，我觉得不是什么大问题
而且这技术细胞要固定的，只能看某个时间点。而做single cell的最好是能观察活细
胞

S*e2016-09-17 07:09

3 楼

的。
我非常不喜欢这个领域。
一类是灌水文，整一堆数据做分析，炒作概念，比如之前的Pol II Pausing, Super
Enhancer等等。发了无数的CNS，找到什么了？根本不知道怎么调控的，或者怎么调节
这些状态。
还有一类是利用表观遗传学的很多功能性的文章。到最后把机制做到各种表观遗传学的
变化就认为找到机制了。其实往往解释不下去了，找个转录调控来下台阶。这里头其实
表观遗传学的调控根本很有可能就是被动的。比如说表型A是因为表观遗传学的酶B活性
变化影响了靶基因C,D,E，但是这些酶B其实活性是非特异的，他们为什么找到CDE而不
是FGH...根本就不知道为什么。
单细胞是另外一个热点。很酷很强大，但是不找几百个细胞统计一下也没啥意义。统计
完了，估计也没什么新的发现。

【在 j*********g 的大作中提到】

: 想听听各位大神们的高见。
: 单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
: 最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
: 原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
: 饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
: ，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
: 所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
: 基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
: 不需要什么高超的实验技巧。
: 这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的

t*k2016-09-17 07:09

4 楼

那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法

j*g2016-09-17 07:09

5 楼

所以不靠谱？
[在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]
:那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法

t*k2016-09-17 07:09

6 楼

这个就不知道了。。。

: 所以不靠谱？

: [在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]

: :那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法

【在 j*********g 的大作中提到】

: 所以不靠谱？
: [在 teekeetk (teekeetk) 的大作中提到：]
: :那文章是几年前的了吧。貌似没有看到有其他实验继续用过这方法

i*02016-09-17 07:09

7 楼

某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
啥的都是演员么。。。。

j*g2016-09-17 07:09

8 楼

表观遗传更多的是一种缓冲系统，fine-tuning。
[在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
:某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
:啥的都是演员么。。。。

R*n2016-09-17 07:09

9 楼

能提供个文章或者详细说明么？我现在有个课题应该需要这个技术，多谢！

的。

【在 j*********g 的大作中提到】

i*02016-09-17 07:09

10 楼

和miRNA一样么？

TF

【在 j*********g 的大作中提到】

: 表观遗传更多的是一种缓冲系统，fine-tuning。
: [在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
: :某华人表观遗传大牛不是说『表观遗传』是生命活动的总导演么，其他的诸如DNA，TF
: :啥的都是演员么。。。。

R*n2016-09-17 07:09

11 楼

昨天看了下ｐｒｏｔｏｃｏｌ,如果一抗不很好的花，不是有很多ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ.

j*g2016-09-17 07:09

12 楼

一来组蛋白抗体有很多很好的，尽量用验证过的，参考 http://www.histoneantibodies.com
二来得是组蛋白修饰一抗和你的probe同时存在才会发光；两者都不特异的概率很低，
使得非特异性大大下降。

【在 R****n 的大作中提到】

: 昨天看了下ｐｒｏｔｏｃｏｌ,如果一抗不很好的花，不是有很多ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ
: ｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ.

R*n2016-09-17 07:09

13 楼

昨天定了duolink的kit,看看效果如何。
有没有biotin labelled DNA probe和一抗共染的比较好的protocol,有经验的ｓｈａｒ
ｅ一下吧

【在 j*********g 的大作中提到】

: 一来组蛋白抗体有很多很好的，尽量用验证过的，参考 http://www.histoneantibodies.com
: 二来得是组蛋白修饰一抗和你的probe同时存在才会发光；两者都不特异的概率很低，
: 使得非特异性大大下降。

j*g2016-09-17 07:09

14 楼

文章里面的不行吗？
做成了，做不成，都记得来说说你的经验和教训哈。

【在 R****n 的大作中提到】

: 昨天定了duolink的kit,看看效果如何。
: 有没有biotin labelled DNA probe和一抗共染的比较好的protocol,有经验的ｓｈａｒ
: ｅ一下吧

s*g2016-09-17 07:09

15 楼

大家都买了啥kit了。说来听听
结果我也是静等花开。谢谢

s*g2016-09-17 07:09

16 楼

另外，是否有验证两个细胞蛋白近距离接触的荧光显示kit?
细胞膜表面的信号通路起始蛋白间的吸引靠近。

g*52016-09-17 07:09

17 楼

https://www.youtube.com/watch?v=3N39R2as-84

【在 s*****g 的大作中提到】

: 另外，是否有验证两个细胞蛋白近距离接触的荧光显示kit?
: 细胞膜表面的信号通路起始蛋白间的吸引靠近。

R*n2016-09-17 07:09

18 楼

我quickly update一下，做了一个已知的DNA和histone modfication的组合（1个ctl,2
个KD），一次就成了。一抗用的是自己的buffer,二抗用公司的kit。信号非常强，都集
中在核内，这个和预期相符。其中一个KD，确实看到较少的foci.基本和下面这个一样。
https://www.youtube.com/watch?v=RFTbb5xd6iQ
有两个问题，
1）视频2：40时候，cover glass是用什么粘上去的？
2）我最后上mounting media的时候，有时候会有模模糊糊的一层影响DAPI的信号，但
是其他红光没影响，有时候同一批有的好有的不好。而且封片前都用水洗一下的，因为
有人告诉我是盐。肯定不是mounting media的问题，都是新的。

【在 j*********g 的大作中提到】

: 文章里面的不行吗？
: 做成了，做不成，都记得来说说你的经验和教训哈。