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质谱蛋白定量的问题

质谱蛋白定量的问题# Biology - 生物学

B*v2018-03-13 07:03

1 楼

1. 现在质谱的灵敏度有多高了，一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗？我记得以前起
码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
2. 用质谱做全细胞proteomics定量，信号是否很难解析？因为一些house keeping
protein量太大，会干扰其他量低的蛋白的信号？
3. 用质谱比较两个蛋白的表达量是否准确，比如说信号强度1:5，蛋白量也是1:5？我
以前的经验是蛋白量远大于这个比例，比如1:100

Y*U2018-03-13 07:03

2 楼

1. 可以
2. 你提的问题是存在的，但是现在蛋白组的覆盖率已经很高了，通常覆盖几千个蛋白
不成问题，但极低丰度的蛋白仍然难以被检测。
3. 基于同位素标记的手段最准确，非标记定量也有很多人在用了。通常有一些
normalization的手段，直接看信号强度不太准确。

K*S2018-03-13 07:03

3 楼

1. 20Kd 和200 Kd的就差10倍, 看你是什么蛋白了，氨基酸序列是否好离子化。一般来
说没问题。
2. 你是指相对定量还是绝对定量？
3. 不同蛋白的质谱信号不能做定量比较的

：1. 现在质谱的灵敏度有多高了，一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗？我记得以前
起码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
：

g*x2018-03-13 07:03

4 楼

pico mole is enough, but this depends on how complex your sample is. If you
know what your target is, instead of doing shotgun proteomics, you can
develop a targeted method so the sensitivity can be improved by 5-10x.
For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and
quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree)
before digestion.
On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or
static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance
protein will not cover the signals from other peptides.
Depends on your instrument and quantification method, as well as your sample
.
Based on my experience in label-free quantification, the ratio is still
accurate within 2 orders of magnitude dynamic range.

【在 B***v 的大作中提到】

: 1. 现在质谱的灵敏度有多高了，一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗？我记得以前起
: 码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
: 2. 用质谱做全细胞proteomics定量，信号是否很难解析？因为一些house keeping
: protein量太大，会干扰其他量低的蛋白的信号？
: 3. 用质谱比较两个蛋白的表达量是否准确，比如说信号强度1:5，蛋白量也是1:5？我
: 以前的经验是蛋白量远大于这个比例，比如1:100

n*02018-03-13 07:03

5 楼

你说的dda 的exclusion list 效果能有多好呢?而且他要是定量的话，你的
housekeeping 蛋白都exclusive了还怎么能相对定量?
应该是dia吧 data 全记录。
2. 用质谱做全细胞proteomics定量，信号是否很难解析？因为一些house keeping
For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and
quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree)
before digestion.
On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or
static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance
protein will not cover the signals from other peptides.

g*x2018-03-13 07:03

6 楼

LFQ用的是MS1的intensity进行定量，MS2只起到identification的作用。所以只要
retention time和mass从MS2中得到了确认，就可以从MS1中得到相当完整的intensity
信息。
如果你打算做MS2-based的定量，当然不能用dynamic exclusion。
abundance

【在 n********0 的大作中提到】

: 你说的dda 的exclusion list 效果能有多好呢?而且他要是定量的话，你的
: housekeeping 蛋白都exclusive了还怎么能相对定量?
: 应该是dia吧 data 全记录。
: 2. 用质谱做全细胞proteomics定量，信号是否很难解析？因为一些house keeping
: For full cell lysate sample, if you wanna do ultra-deep discovery and
: quantification, routinely you need to do fractionating (sec, iex, gelfree)
: before digestion.
: On current MS instrument, data-dependent acquisition can do dynamic or
: static exclusion for the peptide precursors, so peptides from high-abundance
: protein will not cover the signals from other peptides.