N6-甲基腺苷（m6A）是RNA甲基化修饰中最常见的形式，是生信研究的热点方向，相关研究也比较容易发到影响因子在3~10分之间的期刊。m6A调控在肿瘤发生中起着重要作用。经常关注挑圈联靠的小伙伴想必对m6A相关文献套路已经不陌生了。今天我们再分享一个套路：与m6A相关的非编码RNA对肿瘤预后的影响与signature的筛选。
m6A和ncRNA两个发文热点加在一起是否会有更热烈的化学反应呢？冲更高分呢？
老样子，打开Pubmed，输入m6A ncRNA prognosis，做做市场调查！一共196篇文章，其中接近一半96篇都是还没结束的今年发表的！又是一个新兴热点！按相关性排序，扑面而来一堆Molecular Cancer的40+，天花板可以说是很高！接下来看点画风“正常”的，按出版时间来，很多小伙伴今年新发表的文章还是不错的，保底也有5+，好好做，10+期刊也是不难的。
低至3+5+兜底，高到10+高分文，根据自己需要。
双热点加持！ncRNA种类丰富，有很大挖掘空间！
也只需公共数据库挖掘就能搞定！
光看影响因子是不够的！下面我们就根据一篇10+涉及lncRNA的文献按“挑圈联靠”的套路举例说明一下文章（参考文献里有加粗）。
一、CRC中m6A RNA甲基化调节因子的表达情况（挑）
研究者首先比较了TCGA数据集中19个m6A相关的RNA甲基化调节因子在CRC中的表达。结果发现，除YTHDC2外，所有19个基因在CRC组织中的表达都与正常组织有差异（图1A）。小提琴图显示，CRC组织中的METTL3, WTAP, KIAA1429, RBM15, ZC3H13, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, HNRNPA2B1, HNRNPC, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ALKBH3和FTO与正常组织相比，显著上调；然而CRC组织中的METTL14、YTHDF3和ALKBH5显著下调（图1B）。研究者进一步评估了CNV模式与m6A RNA甲基化调节因子的表达之间的关系。结果表明，m6A调节剂的表达水平与不同的CNV模式有明显的关系。研究结果显示，除了IGF2BP1和IGF2BP3，CNV的增加与较高的基因表达有明显的相关性，而CNV的缺失则导致基因表达的下降（图S1）。研究者确定了19个m6A RNA甲基化调节因子之间的Spearman相关性分析。m6A RNA甲基化调节因子之间的相关性大多为正，KIAA1429和YTHDF3是最正相关的（Cor = 0.81）（图1C）。研究者展示了m6A RNA甲基化调节因子表达与CRC不同临床病理特征之间的关系，包括性别、年龄、肿瘤分期、T期、M期、N期和生命状态（图1D）。二、共识聚类确定了两个ESCC患者的群组(cluster）以及它们与临床病理参数的关系（圈、靠）
使用 "ConsensusClusterPlus "软件包构建了一个由20个m6A RNA甲基化调节因子组成的一致集群。图3A，B显示了共识集群的累积分布函数（CDF）从k=2到9的相对变化，以及CDF曲线下的面积从k=2到9的相对变化，事实证明k=2时，来自TCGA的ESCC队列被分为两个不同的聚类是最合适选择（图3C）。图3D展示了k=2到k=10的跟踪图（tracking plot）。聚类亚群与患者的临床病理参数之间的关系显示，聚类1和聚类2与患者年龄、性别、T期、N期、M期或TNM期之间没有意义（图3E）。
三、WGCNA分析，找到共表达的m6A相关的mrna和lncrna（挑）使用R软件包edgeR，研究者在TCGA数据集中确定了700个lncRNAs和3637个mRNAs进行进一步分析（图S4）。通过WGCNA，将不同RNA归入不同的模块，确定好模块的范围后选择模块关键基因（ME），作为一个给定RNA模块的主要成分。将ME作为一个模块的特定基因表达模式；依此总结基因表达谱，并计算ME与m6A调节因子表达水平的相关性，以确定与m6A相关的lncRNA和mRNA模块。最终，研究者确认了六个lncRNA共表达模块，并评估了它们与12个OS相关的m6A RNA甲基化调节因子的关联（图4A和4B）。选定的不同模块中ME的散点图显示，蓝色、棕色和绿松石色的模块与m6A调节因子有明显的相关性，包括YTHDF1、ALKBH3、ALKBH5和FTO（图4C-4H）。共有544个lncRNAs参与了这三个模块；我们将那些与m6A调节因子相关的lncRNAs定义为m6A相关的lncRNAs。至于mRNAs，有10个模块被确定为进一步分析的对象（图5A和5B）。此外，与其他模块相比，红色和绿松石色的模块与m6A RNA调节因子明显相关（图5C-5H）。这两个模块中共有1292个mRNAs被认为是与m6A相关的mRNAs。五、lncRNA的预后分析（预后m6A相关lncRNA signature的构建和验证)（靠）
利用预后信息，应用单变量Cox回归，从训练集中的544个m6A相关lncRNAs中识别出预后的m6A相关lncRNAs。其中37个m6A相关的lncRNAs与训练集中的CRC个体的OS显著相关。将这37个预后良好的m6A相关lncRNAs的基础上构建了LASSO Cox分析，并产生了m6A相关lncRNAsignature，其中包含24个m6A相关lncRNAs（图S5A和S5B）。根据每个lncRNA的系数（coefficient），计算出每个受影响个体的风险分数。根据风险评分的中位数，将患有CRC的受试者分为低风险组和高风险组。Kaplan-Meier（K-M）生存曲线显示，低风险组的CRC受试者比高风险组的受试者有更好的临床结果：训练组（p = 9.5 × 10-7）（图6A），测试组（p = 2.44 × 10-4）（图S6A），以及TCGA队列总数（p = 1.79 × 10-9）（图S6E）。ROC曲线显示，在训练集（图6B）、测试集（图S6B）和TCGA总队列（图S6F）中，m6A相关的lncRNA signature表现出预测OS的强大准确性。六、mRNA的预后分析（预后m6A相关mRNA signature的构建和验证)（靠）在训练集中，使用单变量Cox回归，75个mRNAs被确定为预后的m6A相关mRNAs。此外，LASSO Cox分析被用来构建一个m6A相关的mRNA signature，涉及33个预后的m6A相关的mRNAs（图S5C和S5D）。根据风险评分的中位数，CRC受试者被分为低风险和高风险组。Kaplan-Meier生存曲线表明，风险分数较高的CRC受试者的临床结果较差（OS时间较短，OS率较低）（图6E）。ROC分析显示，在训练数据集中，m6A相关的mRNA签名具有预测OS的能力（1年曲线下面积[AUC]=0.853，3年AUC=0.891，5年OS=0.892）（图6F）。在测试集（图S6I-S6L）和TCGA总队列（图S6M-S6P）中验证了m6A相关mRNA签名的预后能力。这些结果显示了该特征的强大的OS预测能力。七、m6A相关的lncRNA和mRNA signature是CRC患者的独立预后因素（靠）对TCGA数据的临床病理参数，进行单变量和多变量的Cox回归分析，以确定与m6A相关的lncRNA和mRNA signature的计算的风险分数是否准确预测了CRC个体的预后。结果显示，m6A相关的lncRNA和mRNA signature与OS有明显的相关性，在训练集中，这些特征是OS的独立预后因素（图7A和7B）。这些结论在测试集（图S7A和S7B）和整个TCGA队列（图S7C和S7D）中得到验证。研究者探索风险分数是否与临床病理特征的相关性分析。结果发现，与低风险组相比，高风险组与较高的死亡率和较高的肿瘤分期显著相关，但与年龄和性别没有关系（图7C和7D）。研究者还分析了m6A相关lncRNA和mRNA signature与干细胞表型和药物敏感性之间的关系。研究发现m6A相关的lncRNA和mRNA signature与CRC干细胞表型明显相关（图S8），而且这两个签名中的高危对象可能对药物治疗更敏感（图S9）。多变量Cox分析和风险分数是否与临床病理特征的相关性分析，m6A相关lncRNA和mRNA signature，是否具有独立的预后意义
八、基于m6A相关lncRNA和mRNA signature的列线图构建和校准曲线验证（靠）为了创建一个适用的临床评估工具，以提高预测CRC患者OS的准确性，构建列线图，以预测训练数据集中1年、3年和5年的OS概率（图8A）。图B的校准曲线图显示列线图预测和实际3年OS的比较，列线图的性能在预测3年OS时最好。如图8C所示，在决策曲线分析（DCA）中，列线图在预测相应的1年、3年和5年的OS时，表现出更广泛的阈值概率的净效益。正如DCA所验证的，图8D描述了与m6A相关的lncRNA和基于mRNA signature的风险评分相比，列线图的净临床效益更大。图8E中，KM生存曲线显示,基于列线图的风险评分的中位数，分为两组的CRC受试者的OS。图8F中，与时间相关的ROC曲线显示了在列线图基础上预测1年、3年和5年的OS方面有很好的预后准确性（AUC=0.844、0.855和0.824，分别）（图8F）。根据列线图的风险评分，受试者按中位数分为两组。结果表明，高风险组的受试者与低风险组的受试者相比，其结果明显更差（P < 0.001）（图8E）。使用测试集和TCGA队列总数进行验证，我们验证了同样的结果，如图图S10所示。
一些文献里随处可见的常规分析和更多高级分析也是有的！RNA修饰套路
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1+1>2! 这篇7+m6A单细胞代表作模板，直接整高级！
1、Li J, Rao B, Yang J, Liu L, Huang M, Liu X, Cui G, Li C, Han Q, Yang H, Cui X, Sun R. Dysregulated m6A-Related Regulators Are Associated With Tumor Metastasis and Poor Prognosis in Osteosarcoma. Front Oncol. 2020 Jun 2;10:769.（IF=5.738）2、Guo W, Tan F, Huai Q, Wang Z, Shao F, Zhang G, Yang Z, Li R, Xue Q, Gao S, He J. Comprehensive Analysis of PD-L1 Expression, Immune Infiltrates, and m6A RNA Methylation Regulators in Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Front Immunol. 2021 May 12;12:669750.（IF=8.786）3、Li W, Gao Y, Jin X, Wang H, Lan T, Wei M, Yan W, Wang G, Li Z, Zhao Z, Jiang X. Comprehensive analysis of N6-methylandenosine regulators and m6A-related RNAs as prognosis factors in colorectal cancer. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Dec 14;27:598-610. （IF=10.183）
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撰文丨三叶虫
排版丨三叶虫
编辑丨三叶虫
