根据scRNA-seq数据，寻找差异数据，得到signature来对预后进行分析是生信常见套路，也是发文高分热门领域之一。但越来越多的小伙伴加入这个套路后，发文会越来越卷，稿件接收要求会水涨船高，也是可以预见的事。但如果想给自己的单细胞文章增加一个新方向呢？细胞间的差异数据类型可以是不同的，引发差异的原因也可以是不同的。只需要换一换科学问题，套路都是一样的。很多前几期文章用的新方法也可以组合进来。
输入signature ferroptosis，不仅文章发表趋势仍在持续增长，而且绝大多数都是去年和今年才发表，一共454篇，今年就发表了247篇，占据了一半以上！再按出版时间看看小伙伴们最新发表的文章，最少也都在5+或6+。可见，如果做单细胞signature，加个细胞死亡，相当一段时间内还是大有可为的。
下面我们就根据2篇最近一个月5+文献整理一下研究套路，看看如果我们现在就动手准备，最保底能发几分的文章！Yao W, Liu X, He Y, Tian M, Lu S, Wang Q, Zheng Y, Lv Z, Hao C, Xue D, Meng X. ScRNA-seq and bulk RNA-seq reveal the characteristics of ferroptosis and establish a risk signature in cholangiocarcinoma. Mol Ther Oncolytics. 2022 Sep 26;27:48-60. (IF=6.331)
Zhang Y, Liang Y, Wang Y, Ye F, Kong X, Yang Q. A novel ferroptosis‑related gene signature for overall survival prediction and immune infiltration in patients with breast cancer. Int J Oncol. 2022 Dec;61(6):148. (IF=5.884)
GSE138709 5个肿瘤组织、3个邻近组织、33694个基因和40919个细胞 CHOL scRNA-seq数据。GSE107943 30个CHOL样本，27个癌旁组织 RNA测序数据和临床信息TCGA-CHOL 36个CHOL和4个癌旁组织 RNA-seq数据和相应的临床信息。关于铁死亡的研究套路，我们也可以归纳到“挑圈联靠”的套路里。一、不同免疫细胞的比例（挑，选出预后最好的免疫细胞）为了评估各种免疫细胞浸润在组织细胞中的作用，利用RNA-seq数据分析了免疫细胞的比例及其对癌症预后的影响。CIBERSORT根据TCGA数据库的RNA-seq数据预测22种免疫细胞的比例（图1A）。研究者又对22种免疫细胞做了生存分析，单核细胞（Monocyte）的患者预后更好（P = 0.01）（图1B）。所以，研究者对癌和癌旁组织中单核细胞的浸润情况做了进一步。二、scRNA-seq分析表明单核细胞和CHOL细胞之间的交流(挑、圈、联）使用tSNE对scRNA-seq数据集（GEO: GSE138709）进行降维聚类，形成22个聚类（图2A），划分细胞亚群。图2B的热图显示每个细胞亚群的标记基因，依此对组织细胞（聚类0、2和5；标记物STMN1、KRT19和CLDN4）和符合研究者要求的免疫细胞——单核细胞（聚类3；标记物S100A9、S100A8和LYZ）进行分类（图2B）。图2D的点图展示了单核细胞和组织细胞之间相互作用，发现TNFSF13B和TFRC之间的关系是显著的（P＜0.01）。TNFSF13B_TFRC对的出现次数在排名前30的细胞间关系对中排名第21位，足以说明其高频率（图2E）。对细胞亚群的标记基因进行了KEGG功能富集分析，但明显富集的途径不包括铁死亡途径（图2F）。样本中单核细胞和组织细胞之间的细胞间交流分析（图2C）显示了单核细胞浸润对组织细胞的影响。细胞通讯热图显示，胆管细胞（组织细胞）和内皮细胞之间的交流通讯最为突出。第二个最突出的通信是胆管细胞和单核细胞、巨噬细胞之间。在这里，一边挑选差异，一边做功能富集，“挑”的同时“圈”，因为我们要落实到不同细胞间功能的不同。
组织细胞的功能富集中没有发现TFRC相关的铁死亡信号通路，接下来研究者继续对组织细胞的细胞亚群重新进行细分，做tSNE图，重新得到9个亚群（图3A）。根据从KEGG数据库检索到的铁死亡基因signature的热图，铁死亡基因在C0、C1、C3、C4、C5、C7和C8中的富集程度较高，TFRC基因在C4亚群中明显过表达。铁死亡基因在C2和C6中的富集程度明显降低，TFRC基因在C6亚群中明显表达不足（图3C）。CNV分析显示，C0、C1、C3、C4、C5、C7和C8的拷贝数突变程度较高，表明它们是恶性细胞亚群。C2和C6的拷贝数突变程度较低，表明它们是良性的细胞亚群（图3D）。
研究者对C4（图3E）和C6亚群（图3F）的标记基因进行了KEGG功能富集分析。C4中的大部分通路与癌症直接相关，而C6中的通路与癌症没有直接关系，验证了从CNV推断的细胞亚群的良性和恶性鉴定结果。基于TFRC在C4中明显高表达而在C6中明显低表达，研究筛选了所有在C4中明显上调而在C6中明显下调的基因进行功能富集分析，结果显示，其中铁死亡的富集程度排在第五位（图3G）。
这些结果表明，与良性细胞相比，铁死亡途径在组织细胞中明显富集；单核细胞通过与组织细胞（TNFSF13B-TFRC）的交流，启动了部分癌细胞群的铁死亡。
为了进一步探索单核细胞在组织中的潜在作用，对TCGA数据进行WGCNA分析，构建共表达网络，确定共表达模块（图4A和4B），图B展示网络拓扑结构的性质，
分析不同模块与单核细胞（免疫细胞）高浸润和低浸润比例之间的相关性（图4C）。深绿松石色和棕褐色模块（共552个基因）与单核细胞浸润显著相关（P < 0.05），结果显示与高浸润呈负相关，与低浸润呈正相关。从FerrDb数据库中获得与铁死亡相关的基因。铁死亡相关的基因、单核细胞相关基因与差异表达的基因集相交，然后进行合并，做火山图（图4D），获得与铁死亡或单核细胞浸润的基因集交集，做维恩图（图4E）。对这些基因进行单变量Cox分析，筛选出单核细胞和铁死亡相关的基因（P<0.05），共9个基因。（图A）再对这9个与预后相关的基因进行多变量Cox回归分析，构建了一个三基因的预后signature。（图B）再对这三个基因及其相关基因三个基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，显示蛋白作用间的关联。根据这三个基因的表达值和相关系数，计算出每个患者样本的预后风险得分。
图5D和5E显示了TCGA-CHOL和GEO两个数据集分别的总风险得分（上图）、生存时间（中图）和单基因表达水平（下图）。
根据图5D和5E中显示的每个病人的风险评分，用最佳截止值将病人分为高风险组和低风险组。
接下来验证signature的临床效果，也同样是“靠”为了验证铁死亡-单核细胞（F-M）signature在不同数据平台上的预后性能，我们使用TCGA-CHOL作为训练集，GSE107943作为验证集。图6A和6C分别是TCGA-CHOL和GSE107943中高风险组和低风险组的KM生存曲线。在两个数据集中，CHOL患者的生存结果都有明显的不同（对数等级P<0.01）。ROC曲线被用来评估F-M特征对患者预后的敏感性和特异性。结果显示，TCGA-CHOL数据集表现更好，1年、3年和5年的曲线下面积（AUCs）分别为0.866、0.869和0.933（图6B）。GSE107943数据集的1年、3年和5年的AUC分别为0.618、0.792和0.910（图6D）根据TCGA数据的临床数据，使用决策曲线分析（DCA）重新评估了该预后特征在预测1年、3年和5年生存率方面的表现。结果显示，F-M特征在1年、3年和5年内比其他临床信息有更好的预测能力（图6E-6G）。
七、基于K-M生存分析和GSEA的列线图signature的构建（靠、圈）为了评估signature的应用潜力，我们将风险评分整合入列线图（图7A）。校准曲线显示，实际观察值与预测值很一致（图7B）。事实上，提名图风险评估图还可以将风险评分与临床特征相结合，以达到更好的临床应用价值。在基于基于单基因的KM曲线生存分析（图7C-7E）中，三个基因的低表达组有较好的预后，其中BNIP3和TMEM107有明显的预后效果，有一定的能力来区分患者的生存时间。根据F-M特征的中值，将TCGA-CHOL数据分为高分组和低分组，进行基于KEGG途径的基因集富集分析（GSEA），以获得可能参与F-M特征中三个基因调控的途径。（图7F-图7G）。
关于根据铁死亡相关基因筛选signature的文献套路就给大家介绍到这里了！和以往的基因signature套路一样很好发高分！各种高大上的新名词，只要能影响组织细胞，几乎都能轻松套用！单细胞signature
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撰文丨三叶虫
排版丨三叶虫
编辑丨三叶虫
