1个不务正业科学家的发明，让全世界科研人多了2小时摸鱼时间......
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文章来源 | 科学大院（id：kexuedayuan）
撰文 | Ivan
9月28日，素有“诺奖风向标”之称的拉斯克奖揭晓，临床医学研究奖授予了香港中文大学的卢煜明教授，表彰他在使用胎儿DNA开发无创产前检测方面的突出贡献。
10月3日，备受瞩目的2022年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，瑞典科学家斯万特·帕博（Svante Pääbo）获奖，表彰他在已灭绝古人类基因组和人类进化方面的发现。
但无论是利用母亲血液里的DNA去检测胎儿的唐氏综合征，还是从几万年前的尼安德特人骸骨中提取DNA并进行测序，都离不开另一项伟大的技术——聚合酶链式反应（PCR）。
是的，就是那个被称为“生物狗基本生存技能”的PCR，毕竟生物实验中用到PCR的地方实在太太太多了！
来欣赏一下《PCR之歌》，感受生物狗对这项伟大技术的虔诚（强烈建议做不出实验时可以听听）～《PCR之歌》是伯乐公司（Bio-rad）为推广新产品而编写的，原名Scientists for Better PCR
视频来源：Bio-Rad
PCR在生物实验中到底有多常见？毫不夸张地讲，从顶尖实验室到大学课堂，从国际空间站到医院检验科，你基本都能看到PCR仪的影子，它几乎成了生物学、医学研究中最必不可少的工具。
用于PCR的热循环仪
图片来源：wikipedia
PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），这是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。它的基本原理并不复杂，简单而言，就是用人工技术不断地循环复制DNA，让它1变2，2变4，只需要循环10次就能得到原来1000倍的DNA，如果循环了20次就能得到惊人的100万倍DNA！
PCR循环主要分3步：变性，退火，延伸。
变性：用高温（94-96°C）让DNA双螺旋结构变性，使两条互补链分开变成单链；
退火：降低温度（50-65°C），让引物与单链DNA结合，形成局部双链；
延伸：DNA聚合酶（Taq酶，最佳活性温度约为75-80°C）跟在引物后面，给单链DNA合成另一条互补的链，DNA的复制就完成了。
PCR循环示意图
图片来源：wikipedia
在自然状态下，我们能提取到的DNA样本浓度一般都比较低，只有经过扩增后才能用于测序等操作。在PCR技术诞生前，这可不是个轻松的活，扩增DNA序列需要在细菌中进行，整个过程极为麻烦且漫长，需要历时数周；而现在有了PCR技术，我们只需要往管子里加入原材料，然后扔进PCR仪里跑上几十个循环，就可以轻松得到大量DNA序列～
用于批量检测的PCR八联排管
图片来源：wikipedia
等待PCR仪跑循环的那一两个小时，不知是多少生物狗光明正大摸鱼的好时光。不过这么好用的技术，它的诞生过程却画风清奇，如今正值PCR在学术圈大放异彩之际，我们可以简单回顾一下它传奇的诞生过程。
牛顿曾说过，“如果我比别人看得更远，那是因为我站在巨人的肩上。”作为分子生物学腾飞标志的PCR技术，它的诞生同样离不开多位前人的铺垫，事情还要从分子生物学的蛮荒年代说起。
1953年4月25日，剑桥大学的两个年轻人詹姆斯·沃森（James Watson）和弗朗西斯·克里克（Francis Crick）发现了DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，也为日后PCR的诞生打下最基础的理论依据。1962年，他们被授予诺贝尔生理学或医学奖。
詹姆斯·沃森（左）和弗朗西斯·克里克（右）
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1956年，美国生物化学家亚瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg）发现了第一个DNA聚合酶。人类得以窥视复杂的DNA复制机制，PCR无限扩增的原理就是建立在此之上：复制DNA需要先打开DNA双螺旋，并保持其打开状态，接着在酶的作用下合成新的DNA，最后再去除引物，并将所有片段连接在一起。1959年，科恩伯格被授予诺贝尔生理学或医学奖。
亚瑟·科恩伯格
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20世纪60年代初，印度裔美国生物化学家哈尔·葛宾·科拉纳（H. Gobind Khorana）在破译遗传密码子方面取得了重大进展。除此以外，他还开发了许多合成寡核苷酸所需要的技术，寡核苷酸对于PCR至关重要，常被用作DNA聚合酶的引物。1968年，科拉纳被授予诺贝尔生理学或医学奖。
哈尔·葛宾·科拉纳
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1971年， 科拉纳和他的学生谢尔·克莱普（Kjell Kleppe）在Journal of molecular biology杂志发表的论文中，首次提出“使用DNA聚合酶进行修复合成”的概念，这也被视为PCR技术的早期构想。
1969年，美国微生物学家托马斯·布洛克（Thomas D. Brock）从黄石国家公园的大棱镜温泉中分离出一种全新的嗜热菌Thermus aquaticus，它们能在85℃以上的温泉里生存。
1976年，中国台湾的女科学家钱嘉韵在辛辛那提大学生物系读研期间，从这种嗜热菌中提取了能够耐高温的Taq聚合酶，这种酶后来被用于取代不耐高温的大肠杆菌DNA聚合酶，大大简化了PCR工作。
发现了Thermus aquaticus嗜热菌的温泉口，这美丽的彩虹色其实是嗜热菌的颜色
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1977年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）发明了著名的桑格测序法。有了高效的DNA测序方法，人类终于能够方便地读出DNA片段序列，让设计PCR引物的难度大大降低。1980年，桑格被授予诺贝尔化学奖。
弗雷德里克·桑格
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至此，在多位诺奖得主的铺垫下，搭建PCR技术所需的所有零部件已悉数集齐，只等一个天选之子去将它们组装到一起。
那个被命运选中的人叫凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis），他于1944年12月28日出生于美国南部小城勒努瓦的一个农民家庭。
图片来源：wikipedia
比起使用“传奇”一词，这位天选之子的人生经历用“混乱”去形容似乎更为贴切，实在让人大跌眼镜。
小时候的穆利斯是个不折不扣的熊孩子，搞破坏是一把好手，但这并不影响他以优异的成绩考入全美三大理工院校之一的佐治亚理工学院化学系。上了大学以后，受到嬉皮士运动的影响，他甚至迷恋上了某些不良嗜好，当别的同学都在乖乖上课做实验时，他却白天躲在宿舍吸食LSD（Lysergic acid diethylamide，D-麦角酸二乙胺，这是一种强烈的半人工致幻剂），晚上再偷偷溜进实验室里合成。
本科毕业后，穆利斯进入加州大学伯克利分校攻读生物化学方向的研究生。但他依旧难改吊儿郎当的本性，在读博期间选修了一门与专业毫不相干的——天体物理学。神奇的是，他竟然学得还不错，甚至在1968年发表了一篇Nature论文。最后也是这篇文章帮他歪打正着地拿到了博士学位。
穆利斯的Nature论文《时间逆转的宇宙学意义》
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博士毕业后的穆利斯更加不务正业，先是转行写起了科幻小说，结果非但没能写出传世名作，反而连自己的温饱都成了问题。眼看就要入不敷出，他只得先后跑去堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校做博士后，干起了宰杀小鼠的脏活累活。离谱的是，博后期间他竟然还在家甜品店里打过工。
穆利斯的迷惑行为还有很多——他曾在诺贝尔获奖致辞中反复怀念前女友，结果50岁前就结了4次婚；他不相信全球气候变暖，认为对臭氧层空洞是环保主义者的阴谋；他否认HIV病毒会导致艾滋病，觉得这是政府机构为了赚钱而提出的阴谋；他还宣称自己曾与伪装成浣熊的外星人对话过......
穆利斯的很多迷惑言行，都记载在自传《心灵裸舞》中
图片来源：archive.org
2019年8月7日，穆利斯因肺炎去世，走完了传奇的一生，享年 74 岁。斯人已乘黄鹤去，空留 PCR 在人间。这样一位放浪不羁的非典型科学家，咱们凡人不好评价，还是把时钟拨到80年代，继续说回PCR。
1979年，受够了杀小鼠工作的穆利斯在朋友的推荐下，入职了一家生物技术公司Cetus。Cetus的主营业务是基因产品，而穆利斯的工作就是为全公司的各种研发项目合成寡核苷酸。
Cetus意为鲸鱼座，它于1971年在加州伯克利成立，是最早的生物技术公司之一
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合成寡核苷酸倒也不难，就是很慢。当时手工合成DNA主要是通过模拟体内合成，先将一个个核苷酸按顺序排列好，再连接起来，速度慢得出奇，根本不够实验室的消耗。在化学合成上充满天赋的穆利斯很快开发出计算机自动合成程序，大大简化了工作流程。1981年，他当上了DNA合成实验室的负责人。
1983年一个春天的晚上，穆利斯与当时同在Cetus工作的女友驱车前往乡间的别墅度假。汽车疾驰在加州128号公路上，蜿蜒盘旋的道路渐渐在他眼前幻化成DNA双链，不断离合、延伸……
充满传奇色彩的加州128号公路
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此时一个惊天念头在他脑中闪现——扩增DNA片段时，如果同时添加两条引物分别扩增，是不是只要引物足够，就可以无限扩增下去？
激动万分的穆利斯当即停车，从手套箱里取出笔和纸飞快地演算起来：DNA复制1次能变成2个，复制10次就是大约1000个，复制20次就有100多万个了，要是能复制30次，就有惊人10亿个，这可是人类基因组中碱基对的总量啊！
回到公司后，穆利斯兴冲冲地汇报了自己的想法，但却没有一个人支持他，同事们都认为他对分子生物一无所知，因此对他的想法表示质疑。再加上当时他和女友的感情也出现了问题，并且与实验室其他同事的关系闹的非常僵，实验的进度被严重拖后。
磨磨蹭蹭到了1984年9月，Cetus公司派了几位技术员加入到课题里来，这给了半路出家研究分子生物学的穆利斯很多帮助。有了人手以后，实验就顺利多了。
虽然穆利斯的进度依旧缓慢，但他的2位同事亨利·埃利希（Henry Erlich）和诺曼·阿恩海姆（Norman Arnheim）在当年11月成功扩增了一个110bp的人源蛋白基因片段。事实证明，穆利斯的思路是对的， PCR是可行的！
这就是PCR技术雏形，但那时的PCR技术还不完善，仍有两个问题需要解决。
第一个问题就是高昂的物力耗费。穆利斯最初用的是大肠杆菌DNA聚合酶，这种酶不耐热，温度一高就失活，导致每个循环都重新添加，不但麻烦，而且成本非常高。经过一番搜索，钱嘉韵在9年前提取出的耐高温Taq聚合酶给了穆利斯灵感，在公司另一组科学家的帮助下，Taq酶于1985年秋天被成功提取出来，并被马上应用到了PCR中。
Taq聚合酶
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另一个问题就是没有自动化仪器进行PCR技术操作。当时PCR技术员的工作日常是这样的：先分别将三个水浴槽的温度恒定在变性温度、退火温度和延伸温度，然后将PCR管放进变性槽里泡着，等估摸着变性得差不多了再放进退火槽里，最后放延伸水浴槽里。这可是个十足的苦力活，几十个循环下来，能把人直接累虚脱。
早期的热循环仪，采用了敞口的设计以方便移动样品
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1987年11月19日，Cetus和珀金-埃尔默（Perkin-Elmer）合作开发的PCR仪正式迎来商用，PCR技术实现了自动化，解放了无数技术员的双手。
1986年的热循环仪原型机Baby Blue
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至此，我们熟悉的那个PCR技术终于以完全体问世。
但传奇故事的结尾似乎总是不完美，PCR也不例外。明明有着巨大的市场利润，Cetus公司却抠抠搜搜，只给了穆利斯1万美元的奖金，团队里的其他人甚至只收到了象征性的1美元，这波操作逼得穆利斯在1986年负气出走；1992年，Cetus公司又因为研发失利，含泪以3亿美元的价格将“摇钱树”PCR技术专利卖给罗氏，从此消失在了历史的洪流里。
1993年，穆利斯因发明PCR而荣获诺贝尔化学奖，他在获奖致辞中大谈童年时光与128号公路的神奇一夜，或许这是对他最好的补偿了吧～
PCR技术甫一问世，就为科学家们打开了一扇通往崭新世界的大门。
例如在诞生之初的1986年，Cetus公司就有科学家利用PCR来测定血液中的HIV病毒循环量，并很快证明了可行性！这项成果于1987年被正式公布，人们得以对捐献的血液进行病毒筛查，并直接检测抗病毒药物的疗效。
这项成果由Cetus公司的约翰·斯宁斯基（John Sninsky）主导
图片来源：参考文献1
另一个早期应用就是就是法医学，很多凶案现场都会留下罪犯的DNA信息，但仅凭现场残留的微量DNA做身份鉴定还是不够的，法医们可以借助PCR逆天的扩增能力，对DNA进行体外复制，再与罪犯DNA数据库进行比较，精准锁定凶手。1986年，基于PCR技术的DNA鉴定首次应用于实战，成功确认了多个尸检样本来自同一个人。
PCR的应用还有很多，不仅仅是分子生物学的相关领域和产业，各行各业都留下了它的足迹，包括分子克隆、基因表达、转基因检测、农业与食品致病微生物检测、病原微生物检测、肿瘤诊疗、遗传病检测……可以说，这是一个改变世界的伟大技术。
此外，随着现代分子生物学飞速发展，PCR技术也在日新月异，推陈出新。
在最初的手动水浴基因扩增和第一代自动化控制型以后，人们已不再满足于不可视的PCR操作了，于是在PCR反应体系中加入同位素或者荧光基因，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知样本进行定量分析，这也就是第二代实时荧光定量PCR，简称qPCR（Quantitative Real-time PCR）。如今新冠肺炎核酸检测用的就是实时荧光定量PCR技术。
qPCR示意图
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而目前最新的PCR检测方法则是第三代微滴数字PCR（Droplet-based digital PCR，ddPCR），第三代技术的优点是使用的样本量极少，定量比常规的qPCR更精确，灵敏度更高，在液体活检领域可以大展拳脚。
PCR家族远不止于此，还有例如反向PCR、锚定PCR、Bubble-PCR、反转录巢式PCR……这些种类繁多的PCR技术能够应对人类更高的需要和不同探究方向。
从1983年的灵光乍现至今，PCR技术已经走过了近40个年头，它就像是最牢固的地基，承载着不断升高的分子生物学大厦。下次大家在跑 PCR 时，别忘了感谢一下穆利斯老爷子和神奇的128号公路～
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