日本微生物学家赤池孝章。图源：sairct.idac.tohoku.ac.jp
日本微生物学家赤池孝章等人在1990年前后发现，真正的直接导致被流感病毒感染动物死亡的病理因素，是过量产生的活性氧自由基和活性氮自由基。2022年10月底，我应邀前往日本东北大学医学部，参加由日本东北大学医学部赤池孝章教授主导的世界第12届一氧化氮生物学生物化学与治疗学国际大会。世界各地的自由基生物生化研究学者近300多人，来到刚刚开放防疫国门的日本，参与了这场盛会。肆虐全球的新冠病毒疫情，已经在全球范围内进入一个低风险、区域低流行水平的状态，各国都已经采取常态化疫情管理措施。回顾这次新冠疫情，很多研究者都认识到新冠病毒感染引发过激免疫反应造成炎症因子风暴，是新冠病毒导致肺炎的一个重要机制，但是大多数人没有认识到在炎症因子风暴下并发的活性氧自由基分子风暴，是造成细胞死亡以及多脏器损伤的直接病理因素之一。早在2020年2月武汉出现第一波新冠病毒感染疫情的时候，我在网上应邀做了一个关于如何认识新冠病毒感染的病理机制，以及如何在早期进行自我防疫和治疗的语音讲座。这个语音讲座被整理成文字(https://chinese.zcovid19.org/2020/04/blog-post_5.html)，几天内阅读量就超过5000万。后来通过十几个不同的公众号，至今仍然在中文微信圈里广泛传播。我是从事癌症临床前治疗的基础研究的。之所以给公众介绍自由基损伤在病毒感染机制中的作用以及由此产生的防疫建议，是因为我1990年代在日本熊本大学医学部读博时，在实验室接触到一部分从事呼吸道病毒感染与自由基损伤机制的研究者。其中代表性的人物，是当时的实验室副教授，我的博士导师之一赤池孝章(Takaaki Akaike)博士。赤池孝章等人早在1990年前后发现，呼吸道流感病毒在感染后的第三天左右数量达到顶峰，之后开始迅速下降，一周后基本降低到检测不到的水平。但是在病毒感染的第4天，出现以活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)和活性氮自由基(Reactive Nitrogen Species, RNS)为代表的自由基风暴，该风暴在第6～8天达到顶峰，之后开始降低。但是，被感染的实验动物，开始出现肺炎及多脏器功能损伤，最后死亡。使用活化氧阴离子(O2‾ )清除剂——过氧化物歧化酶(SOD)，或用一氧化氮合成酶抑制剂L-NMMA抑制活性氮自由基风暴，都能够显著地改善被感染实验动物的生存率。他们的研究成果，曾经在《科学》（Science）等学术期刊上发表[1,2]。新冠病毒感染的病程发展，也是经历了类似的三个重要阶段。第一阶段是病毒感染、增殖、消退的阶段，病人感到畏寒、低烧、浑身乏力酸痛等症状。这段时间病毒携带量大，容易感染他人。在病毒感染大约三天后，免疫系统产生的炎症细胞因子也开始大量产生，病毒数量也迅速下降。在炎症因子风暴的顶峰时期，病毒数量下降到低水平。这段时间患者会有高烧等症状。紧随炎症因子风暴之后的，就是氧化自由基风暴。到第三阶段，一般健康正常的人开始进入恢复期，由于自由基分子造成的损伤。一些患者会有咳嗽等症状。但是对有糖尿病高血压等基础病的患者，自由基造成的损伤会导致重要器官发生严重损伤，出现呼吸衰竭、心衰肝衰等严重症状，进入危重状态。对病程的深入认识，对什么时候进行抗病毒治疗、什么时候进行抗炎症治疗等临床治疗方案，有重要的指导意义。病毒在第一阶段（大约一周时间）达到峰值后迅速减少，但是炎症因子风暴和自由基风暴在病毒数量达到峰值前也迅速出现。第二阶段，过激免疫反应阶段。在病毒数量下降后，炎症因子风暴和自由基风暴达到峰值，之后降低及延续，造成细胞和器官损伤。第三阶段，大多数被感染的患者进入康复阶段，但是部分高危人群，由于有基础病，症状加重至危重阶段。坐落在九州熊本市中心白川河畔的熊本大学医学部，由日本江户时代（1756年）肥后藩贵族领主细川重贤设立的医师养成所“医学寮再春馆”发展而来。日本细菌学之父北里柴三郎就是熊本阿苏郡人。赤池孝章于1978年入读日本国立熊本大学艺术与科学学院两年的医学预科班，然后在1980年进入熊本大学医学部，1984年毕业并考取国家医师执照。赤池在医学院读书时，就对微生物学感兴趣。当时内科外科是医学生的首选临床科室，他医学院毕业后，即进入熊本大学附属医院第一内科，一心一意地从事感染症的临床治疗。当时的第一内科教授安藤正幸教授，是世界著名的夏季过敏性肺炎研究的专家。安藤教授亲自指导赤池从事巨噬细胞产生活性氧（ROS）的机制，所以一直到现在，赤池都在研究ROS的生理病理作用。1987年，赤池进入熊本大学医学部大学院（研究生部）攻读博士学位。因为喜欢研究感染症，所以进入前田浩教授所指导的微生物学研究室读博士。在读博士期间，也是以氧化自由基为研究的主题。前田浩教授的研究室，当时以癌症的化学疗法、细菌蛋白酶的病原性等多个方向进行积极的研究。前田教授还是药物递呈系统的研究专家。赤池孝章从第一内科带着研究氧化应激(oxidative stress)在流感病毒肺炎中的病理机制的课题，进入前田浩教授的研究室从事博士研究。在博士研究第二年，他在流感病毒感染的小鼠实验模型中证明，氧化自由基是流感病毒肺炎的主要病原因子。该成果在1989年美国的《科学》(Science)杂志上发表[1]，引起学术界的关注。1990年，更详细的研究结果在美国的the Journal of Clinical Investigation杂志上发表[2]。医学上有一个科赫法则，由德国细菌学家科赫创立，该法则认为，第一，病体罹患疾病的部位经常可以找到大量病原体，而健康的组织/个体中找不到这些病原体。第二，这些病原体可以被分离且纯培养。第三，如果将病原体接种到健康的个体中，会产生相同的疾病特征。第四，在接种后发病的患者病灶上分离出的病原体，其特征与原始分离出的病原体应该完全相同。赤池等人的研究表明，在炎症发生的部位，直接引发炎症反应的可以不是病原体本身，而是病原体引发的机体过度免疫反应，即使在病变部位已经无法检测到病原体的存在。这个发现，是对科赫原则的一个重要补充。1991年博士毕业后，赤池孝章即被前田研究室聘为助理教授，94年聘为准教授（副教授）。我1994年进入前田实验室读博时，赤池博士已经在具体管理实验室的日常运作，所以他既是我的师兄，也是我的导师之一。他异常勤奋，每天早上九点以前到实验室，晚上11点才离开。每天不是在忙于实验、论文，就是在思考什么。他对医学和基础研究有相当广的知识面，对研究前沿有独特的领悟和敏锐洞察力，这在实验室午餐时间进行的论文阅读会中充分表现出来。实验室来自不同临床科室的博士生们，研究课题都与自己的科室研究方向有关，领域也非常不同，但基本上都得到赤池博士的日常指导。2003年，应日本文部科学省的要求，熊本大学校长崎元达郎教授指派赤池教授出任日本文部科学省研究振兴局担任学术调查官，负责科研经费运用的学术行政事务，任职3年。2005年7月，前田教授退休后，赤池担任熊本大学医学院微生物学研究室教授。虽然在这段时间行政事务繁杂，赤池仍在有限的时间和精力下继续他的科学研究。他和泽智裕博士(Tomohiro Sawa，现任熊本大学医学部微生物学教授)及同事们发现了一个新的第二信使因子(second messenger molecule，是细胞内部释放的对第一信号因子的刺激作出信号传导反应的因子) 8-nitro-cGMP。这个研究的初始目标，是从核苷酸(DNA/RNA)分子受损的视点，寻找氧化自由基与一氧化氮自由基作用的目标分子。但是在合成过程中，发现很容易形成8-nitro-cGMP。进一步研究发现，8-nitro-cGMP跟早先人们发现的cGMP有不同的细胞信号传达效应。2007年，他们在Nature Chemical Biology杂志上首次发表了这一研究成果[3]，并作为封面文章得到介绍，多家学术杂志如Nature, News and Views, Chemical & Engineering News做了报道。科学研究出现与当初设计不同的结果甚至失误，是常见的现象。由此引发的偶然发现，即 serendipity 现象，往往引起新的大发现。2007年关于8-nitro-cGMP的论文发表后，日本筑波大学的熊谷嘉人教授与赤池教授联系，进行对8-nitro-cGMP代谢的合作研究。熊谷教授是日本国内外对环境化学物质的亲电子性与毒理学研究享有盛名的科学家。他们的合作的假设是环境化学物质与作为内因性的亲电子物质8-nitro-cGMP应该有共通的调控机制。熊谷研究组认为，以糖酵解反应中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为途径的亲电子物质的解毒经路，与8-nitro-cGMP的代谢有关，因为他们观察到如果用siRNA来抑制GAPDH的表达水平的话，发现8-nitro-cGMP的水平就会升高。这样的话，8-nitro-cGMP就会成为一个新的亲电子性物质的控制机制。可是，后来发现，这个8-nitro-cGMP升高的机制并非经过GAPDH表达水平的调控，因为所使用的siRNA的脱靶效应所导致的误判。这样的初始实验错误导致研究计划的失败，本来是一件研究人员感到难堪的事情。但福由祸转，他们从失败中振作起来，用对GAPDH的非特异性siRNA来做筛查，以这种奇妙的脱靶siRNA筛选技术，发现调控硫化氢的两个重要酶CBS和CSE也参与了过硫化半胱氨酸(cysteine persulfide) 和 多硫化半胱氨酸(cysteine polysulfide)的形成，同时也阐明了如果敲除这两个基因，8-nitro-cGMP的水平就会升高的机制。硫化氢与8-nitro-cGMP的代谢调控机制的研究，一时难以取得进展。他们认识到在这个代谢过程中，还有别的硫磺代谢产物的存在。半胱氨酸(cysteine)的硫醇基团(thiol)与硫磺参与的反应能够生成过硫化半胱氨酸，这个新发现的细胞体内生成的硫磺附加化合物，不仅跟8-nitro-cGMP有反应性，而且还与氧化自由基有反应性，成为一种新的抗氧化剂。这个研究2014年5月在《美国科学院院刊》（PNAS）上发表[4]。大量研究表明，活性氧自由基的氧化应激压力是很多种疾病的病因之一。环境当中被认为是主要的污染物质的重金属、有机低分子化合物、无机气体化合物（例如一氧化氮、硫化氢等）、紫外线、放射线等物质的毒性机制，都与产生氧化应激压力有关。比如说水俣病是由于有机汞(水银)化合物在中枢神经，特别是对小脑中的Purkinje细胞和颗粒细胞有强烈的毒性造成的。这个神经毒性的机制是有机汞化合物对蛋白质有非特异性的烷基化反应(alkylation)造成细胞的变性。但是如前面所介绍的那样，跟熊谷研究组的最新合作研究结果表明，活性硫磺分子的抗氧化作用以及亲电子化合物是细胞内对有机汞化合物的主要解毒剂。也就是说，从感染症的研究开始，漫长的氧化自由基研究，因为一系列偶然的发现，得以进入到环境中毒学研究领域[5]。赤池孝章教授是目前日本微生物学、生物化学界的重量级领军人物。他现任日本东北大学医学部环境医学与分子毒理学教授、东北大学医学部副部长。2018年至今担任日本细菌学会理事长。2018年至2021年曾经担任日本生体防御学会理事长。他曾获得过日本生化学会奖（1998年）、日本细菌学会The Kobayashi Rokuzo纪念奖（2001年）、日本一氧化氮学会奖（2014年），以及日本细菌学会浅川奖（2015年）。他还在2008年至2010年担任国际一氧化氮学会主席、在2008年至2011年担任日本一氧化氮学会理事长，以及担任多个国际学术杂志的编委。在未来的道路上，仍然会有新的病毒感染疫情的发生。大多数研究人员关注病毒本身，希望找到抑制病毒侵入与增殖的药物来清除病毒达到治疗的目的。重视研究机体如何应对外来病毒抗原引起的过度免疫反应造成的损伤，在此基础上总结和研发出新的抗感染药物和疫情防控策略，可以帮助我们全面认识病毒感染与机体防御过程中的病理机制，开发出全新高效的药物和治疗方案，以抵御下一次疫情的挑战。
注：本文于2022年12月27日初稿，2023年3月3日定稿。作者感谢张田力博士的审阅。
作者简介：
吴军，美国希望之城医学中心比较医学系研究副教授。
1.Oda T, Akaike T, Hamamoto T, Suzuki F, Hirano T, Maeda H. Oxygen radicals in influenza-induced pathogenesis and treatment with pyran polymer-conjugated SOD. Science. 1989 May 26;244(4907):974-6. PMID: 2543070.- 2.Akaike T, Ando M, Oda T, Doi T, Ijiri S, Araki S, Maeda H. Dependence on O2-generation by xanthine oxidase of pathogenesis of influenza virus infection in mice. J Clin Invest. 1990 Mar;85(3):739-45. doi: 10.1172/JCI114499. PMID: 2155924.
- 3.Sawa T, Zaki MH, Okamoto T, Akuta T, Tokutomi Y, Kim-Mitsuyama S, Ihara H, Kobayashi A, Yamamoto M, Fujii S, Arimoto H, Akaike T. Protein S-guanylation by the biological signal 8-nitroguanosine 3',5'-cyclic monophosphate. Nat Chem Biol. 2007 Nov;3(11):727-35. PMID: 17906641.
- 4.Akaike T, Nishida M, Fujii S. Regulation of redox signalling by an electrophilic cyclic nucleotide. J Biochem. 2013 Feb;153(2):131-8. PMID: 23248242.5.赤池孝章.寄り道研究：Serendipityと8-ニトロ-cGMPとの出会い 化学療法の領域 Vol.30, 122-128 (2014)
