探索生命科学“终极疆域”，微型化多光子显微镜照亮大脑

2023-04-03 00:04

2023年2月23日，北京大学程和平-王爱民团队在 Nature Methods 在线发表题为《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection》的文章。文中报道了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜，首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。

微型化三光子显微镜首次实现自由行为动物非侵入式深脑成像

海马体位于皮层和胼胝体下面，在短期记忆到长期记忆的巩固、空间记忆和情绪编码等方面起重要作用。在啮齿类动物研究模型中，海马距离脑表面深度大于一个毫米。由于大脑组织特别是胼胝体，具有对光的高散射光学特性，所以突破成像深度极限是长期以来困扰神经科学家的一个极大的挑战。此前的微型化单光子及微型化多光子显微镜均无法实现穿透全皮层直接对海马区进行无损成像。

由于脑组织是高散射介质，来自脑深层的荧光信号达到表面时已经随机散射。台式三光子显微镜使用工作距离大于2mm、数值孔径1.0的大尺寸物镜，在满足深层成像工作距离要求的同时保持足够的荧光信号收集效率。但在微型探头中，如果物镜工作距离为2mm，使用大数值孔径物镜，探头重量和体积就比较大，无法满足自由行为小鼠对于探头重量和体积的要求。

因此，解决这一问题的关键是在减小物镜数值孔径情况下，保持足够的荧光收集效率。

此次微型化三光子显微镜的研发将经典阿贝聚光镜结构引入探头光学构型设计中，将微型阿贝聚光镜与简化的无限远物镜密接以提高散射荧光收集效率，同时在激发光路引入李斯特物镜作为管镜补偿简化物镜的像差，并通过将阿贝聚光镜与李斯特管镜部分复用，实现探头体积的减小。新微型化显微镜构型在工作距离1.75mm、数值孔径0.65、物镜直径仅3.4mm时，实现了与台式三光子显微镜荧光收集效率相当的水平。

在全球，该微型化三光子显微镜首次实现了自由行为动物非侵入式深脑成像解决方案，可穿透小鼠大脑全皮层和胼胝体，实现对海马CA1亚区的直接观测记录，避免植入式Grin Lens损伤脑组织。神经元钙信号最大成像深度可达1.2mm，血管成像深度可达1.4mm。同时，微型化三光子显微镜实现全皮层钙信号成像仅需几毫瓦，海马钙信号成像仅需20-50mw，大大低于组织损伤的安全阈值。

崭露头角——2.2克微型化双光子显微镜，实现自由行为小鼠脑成像

在多光子成像领域，这支来自北大的团队已深耕多年。

2017年，程和平院士领导的北大交叉团队成功研制出第一代2.2克微型化双光子显微镜FHIRM-TPM，在全球首次实现了自由运动小鼠单个树突棘水平神经元功能活动的高速、高分辨率实时成像。该微型化双光子显微镜可实时记录自由行为动物的大脑神经元和树突棘活动，支持钙成像，并可在同一视野长时程反复成像。

此前，在用台式双光子显微镜研究活体小鼠脑活动时，需先麻醉小鼠并将其头部固定。这种情况下，小鼠不能自由运动，无法研究如打斗、哺乳及社交行为，悬尾实验、电击实验等研究受限。此外，台式双光子显微镜不便移动且占用面积较大。

随着科技的发展，部分研究人员引入虚拟现实技术，在小鼠面前放一个显示器，并将小鼠放在跑步机上，在跑的过程中投放虚拟场景并观察小鼠脑活动。但这种方法也饱受争议。其一，在虚拟现实和现实情景中，小鼠大脑神经元的反应情况不一定完全相同；其二，动物在头部固定的情况下会有情绪上的压力，还可能出现应激反应。

据吴润龙介绍，北大团队的微型化双光子显微镜主要有以下几方面突破，一是飞秒激光的柔性传输，普通的光纤在传输飞秒激光时具有很强的色散和非线性效应，导致双光子激发效率变低，北大团队开发了一种新型空心光子晶体光纤，可以无失真地传输920nm飞秒激光，从而高效地进行绿光荧光蛋白双光子激发。

二是成像物镜，传统物镜直径在20mm左右，重量比一般小鼠还重，北大团队开发的微型物镜直径为3.5mm、长10mm，内部有上十个镜片组合，分辨率依然可以达到衍射极限；三是高速成像，为了减少运动带来的伪影，需要快速地进行成像，北大团队通过高速MEMS扫描振镜，在微型化上实现了视频级的成像速度。最后，各项技术的高质量集成，构成了2.2g的高时空分辨微型化双光子探头。

全球范围内，这款“戴着跑”的微型化双光子显微镜第一次实现了自由行为动物的清晰稳定成像，可用于在动物觅食、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化，从而获取小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动的动态图像。

诺贝尔生物学或医学奖获得者爱德华·莫索尔（Edvard.I. Moser）博士曾称这款显微镜是神经科学研究领域中的一个“革命性”新工具。

持续深耕——拓宽脑科学研究的边界，应用场景不断升级

2021年，这支北大团队推出了第二代微型化双光子显微镜FHIRM-TPM 2.0，将成像视野扩大了7.8倍，成像的横向分辨率、轴向分辨率比第一代显微镜高约1.5倍，同时具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力。

除在核心性能上实现升级外，新一代微型化双光子显微镜采用整机一体化设计，满足更小空间实验室的应用。同时具有较强的兼容性，内置激光适配模块，可匹配市面上所有品牌的飞秒激光器，以更强大的成像性能、更广泛的适配性能及更便捷的操作性能为成像技术的发展带来新的活力。

基于微型化双光子显微镜，北大团队与浙江大学的胡海岚团队、中科院孙衍刚团队等开展合作。如孙衍刚团队在研究痒觉感知神经机制，由于痒觉出现过程非常快、神经元发放也很快，而且不同比例的神经元在痒觉感知的不同阶段出现，这要求成像设备不仅需要快速记录单个神经元，还需具备高空间分辨率以区分两类神经元。

此前，大脑皮层对痒觉感知的编码机制的研究多在麻醉动物中进行，这种情况下动物无法通过抓挠行为报告对痒觉的感知。通过微型化双光子显微镜，孙衍刚团队在小鼠自由活动时实现了单细胞分辨率的钙成像，为痒觉机制的研究提供了新的方案。

在应用场景上，北大团队也一直在突破极限。2022年，团队攻克了航天极端环境机体应激与防护等多项技术难题，研制出空间站双光子显微镜。据程和平院士此前的介绍：“在轨实验仪器设备对可靠性、体积、重量、抗冲击和振动性能等有着更苛刻的要求，要想研制出能够进入太空的双光子显微镜并非易事。”

近日，神舟十五号的航天员使用其空间站双光子显微镜，成功获取皮肤表皮及真皮浅层的三维图像，可用于航天员的在轨健康监测。

科研成果产业化的关键一步，

搭建可控的供应链

王爱民提出，由于综合技术等原因，目前全球范围内为数不多的课题组在研究微型化双光子显微镜，只有更多参与者加入，才能更快地推广技术、做大产业。

创新技术的大规模推广离不开产业化。以中国科学院院士及北京大学生物学、医学、物理学和生理学等多学科专家为背景成立的北京超维景生物科技有限公司（以下简称“超维景”）实现了科研成果的产业转化。目前，超维景在北京、南京两地的团队人数已超100人，吸引了在生产、注册、市场推广等领域经验丰富的产业人士加入。

从科研项目走向产业化，除了企业自身的技术积累、差异化产品创新、工艺流程控制外，可控的供应链是关键因素之一。

据王爱民回忆，曾经我们做的第一个“商业化试水”的项目是双光子光片显微镜，其中的一个核心部件变焦透镜只有一家美国公司可以提供，在我们做科研、小范围应用时，可以正常买到，但当我们决定产业化后，这家美国公司便不提供了，这也就直接导致项目“夭折”。

在此后的产业化进程中，超维景选择“自力更生”加“内外合力”的模式。一是自主研发逐步实现双光子显微镜产品核心零部件国产化；二是联合国内相关产业的参与者，由他们根据需求开发新技术。

目前，超维景已建立起可控的产业链，如飞秒激光器、空心光纤、微型化物镜等都已实现国产化，为公司后续医疗产品线的发展打下坚实基础，不仅在研发、生产等环节实现自主可控，还可大大降低生产成本。

两条腿走路，

迈出科研设备的“舒适区”

王爱民提出：“中国脑科学起步较晚，市场不足美国的十分之一，但是2021年中国脑计划正式启动，预计5年500亿的投入。” 同时，双光子显微成像应用于在体病理的研究和应用工作在全球也开展近20年，双光子作为活体成像利器应用于临床诊断研究也展示了应用潜力。超维景坚持科研设备、医疗器械两条腿走路，力求实现从动物到人，更大程度地造福人体健康。

手持式皮肤生物细胞检测仪是公司的首次“试水”。该产品以微型化双光子显微成像技术为基础，实现在体、原位、无创、无标记的微纳米级显微成像，细胞、弹性纤维、胶原纤维、代谢信息等清晰可见。

手持式皮肤生物细胞检测仪主要有两大应用市场。一是临床的应用，在院内进行实时在体的检测。目前院内疾病诊断的金标准是病理检查，需从人体切下一小块组织送检，操作有创且需等待一段时间（一般是3-5天）才能得到检查结果。而很多情况下临床需要快速决策、定期监测，如黑色素瘤、皮肤癌等定期检查。通过手持式皮肤生物细胞检测仪，医生可随时监测细胞形态的变化，观察患者病情变化，以调整治疗计划。

二是皮肤功效检测的应用，超维景正在开展皮肤图谱研究，可用于化妆品、医美技术的评估。据王爱民介绍，化妆品提到帮助改善肌肤状态，但其中并没有客观标准，我们可直接基于对皮肤细胞的观察，检测其中的弹性纤维、胶原纤维，推出客观的皮肤年龄标准，用于评估化妆品的有效性。

在医疗领域，超维景在开发3D 4K荧光内窥镜，在传统内窥镜的基础上加入细胞成像功能，使医生看到更多信息，进一步推动精准诊断。

王爱民提到：“新技术的推广市场教育非常重要，尤其是在保守谨慎的医疗市场。我们要先充分理解医生的使用习惯再去设计产品，创新技术要变成对医生而言真正好用的产品。”目前，超维景正在跟301医院合作，开发一次性内窥镜，用于消化道早癌的筛查、诊断；公司也在与协和医院妇产科联合开展宫颈癌早筛方面的研究。

写在最后

脑科学，无疑是近年来医疗领域最火的命题之一。

人类脑部结构错综复杂，包含千亿个神经元，至今科学家都仍在探索情绪、感情等发生机制。成像技术是脑科学研究发展的关键。从CT、MRI到PET等成像技术，都是为做到“眼见为实”。人类不断追求，在新鲜样本、甚至是活体上直接进行高分辨率成像。多光子显微成像技术在成像分辨率、速度、深度等多方面具有较大优势，赋能脑科学研究。

同时将进一步揭示脑疾病发病机制及指导检测治疗方法的开发。如癫痫、帕金森、阿尔兹海默等神经系统疾病所带来的社会负担、经济负担重，且持续周期长，缺少有效的治疗手段。如果能在疾病机制上有一些新的发现，做到早防早治，可极大地减轻社会负担。

再者，成像技术必将与数字技术特别是人工智能技术紧密结合，“AI+”的成像系统将进一步提高临床医生的诊疗水平。

综合来看，多光子显微成像技术拥有“科研+临床”的广阔应用空间，将成为人类在脑科学研究海域中的一座灯塔，照亮更多隐秘的角落。