雪貂实验解开1918年大流感病原体之谜｜医学有故事 12
上一篇《医学有故事 11 | 1918 年大流感的“吹哨人”》我们说到，医学家们迫切地想知道，1918 年这场凶猛程度史无前例的流感到底是由什么导致的，人类又该如何阻止它的蔓延呢？
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草率的疫苗
早在 1890 年，有一位叫菲佛（Richard Pfeiffer）的德国细菌学家就在流感病人的肺脏中找到了一种杆菌，叫作流感嗜血杆菌，他认为这就是流感的病原体。
B 型流感嗜血杆菌感嗜血杆菌
（"Haemophilus influenzae type B" by Sanofi Pasteur is licensed under CC BY-NC-ND 2.0.）
尽管这个结论是错的，但很多年里没人敢怀疑他。毕竟他是医学大神科赫（Robert Koch，1843–1910）的高徒，而说到细菌研究，科赫几乎可以说是神一般的存在。偏偏流感嗜血杆菌很小，也不容易染色，显微镜下很难观察，更刁钻的是，这种细菌特别难培养。因为这些原因，如果有人在病人肺脏找不到病菌，就会怪自己水平太低，或是被别人怀疑水平太低。
既然权威的菲佛宣布了病原体，接下来当然就是制作疫苗。美国许多公司用流感嗜血杆菌做出疫苗，然后火速推出，给广大市民接种。因为疫情紧急，也没人操心做严格的对照组测试，先打了再说。有意思的是，确实有若干城市报告说，打疫苗之后，流感发病率很快就下降了。
疫苗都有非常精确的针对性。别说用细菌制作的疫苗对病毒不会有效，即便是针对病毒的疫苗，也只对本病毒的本毒株有效，比如麻疹疫苗对腮腺炎没有任何防护作用，甚至乙型流感疫苗对甲型流感都无效。但那些官员报告说流感嗜血杆菌疫苗有效，也并不是在撒谎，他们确实看到了流感发病人数下降。
事情的真相跟群体免疫有关。流感这样的传染性疾病，感染的人只要存活，体内就会产生抗体，在今后几十年里对这个毒株都有抵抗力。因为这个规律，再厉害的流感病毒也只能侵害“新鲜人”，就是从来没接触过该毒株的人。那么某个毒株的流感在某个社区走了一圈之后，可能有若干比例的人死亡，活下来的人都具备了抵抗力，这个社区就此形成群体免疫。此时即便流感毒株依然在社区里飘飞，却越来越难以找到可以侵害的人。1918 年流感疫情凶猛，市政和卫生官员们急于救灾，没人设置对照组来严格检验疫苗的有效性，如果某个地区推行流感嗜血杆菌疫苗的时间恰好赶上流感在那个地方传播的尾声，看起来就像是接种疫苗有效。
1918 年大流感
（"I - influenza epidemic 1918" by jimforest is licensed under CC BY-NC-ND 2.0.）
倘若当时有人想到建立一个对照组，比如把一个地区的人随机抽样分作两半，一半人接种流感嗜血杆菌疫苗，另一半人只接种生理盐水，那就会发现：不管是不是接种疫苗，到了某个时间，这片地方的发病人数都会下降。
你别看这种对照思想听上去似乎是天经地义的，但是，即便是到了今天，绝大多数人并不懂得在生活中去运用它。
猪流感的启发
菲佛的这个“流感”嗜血杆菌理论风行了很多年，一直到二十世纪三十年代，人们才终于找到真正的流感病原体。说来有趣，为这个发现提供关键启迪的不是人，而是猪。
美国一直都非常注重扶持农业和畜牧业，有许多面向农业科技的国立研究所，也频频举办各种博览会，让农民们交流新知识和新技术。1918 年 9 月 30 日，艾奥瓦州锡达拉皮兹举办全国种猪博览会，不料展会期间许多猪患病死亡。联邦动物产业管理局的兽医科恩（John S.Koen）前来调查，注意到这些病猪的症状跟当时正在人间肆虐的流感非常相似：发烧、流鼻涕、打喷嚏、呼吸困难、倦怠无神。他抓住这个线索展开调查，发现其他一些地方的养猪场也陆续出现类似的“猪瘟”，而且正是人类流感暴发的地区。但以往从来没人提到过猪会患流感，教科书里也没这种描述，所以科恩不是十分确定。他只是在报告里说，这种猪群流行病出现的地区，往往也是人类流感暴发的地区，“两者有惊人的相关”，而猪瘟的症状跟人类流感何其相似，强烈暗示两者有共同的病因。
“猪瘟”
（来源：Depositphotos，已获授权）
但是，他的这个说法却让农场主们很不高兴，因为这可能影响猪的销售。他们给政府施压，要求尽量淡化这个报道，于是被科恩揪出的线头又缩了回去。六年之后，才有一位叫肖普（Richard Shope）的乡村医生注意到这根线头，把它给重新揪了出来。
肖普在农场长大，特别喜欢接近自然，所以到了上大学的年龄，他想学的是林业。为这个他来到艾奥瓦州立大学，但那段时间林业学院不招生，他不想空手回家，便临时改变主意，注册成为医学生，于 1924 年获得医学学位。他对开业行医兴趣不大，斟酌之后想转向基础研究领域，就是到实验室里工作，用显微镜和培养皿探索各种跟医学有关的知识。事情很顺利，他在美国普林斯顿的洛克菲勒研究所找到一份工作，研究传染病的治疗技术，跟随的老师是刘易斯（Paul Adin Lewis）。
刘易斯当时正在研究猪霍乱，看到肖普这么熟悉乡村生活，就让他到艾奥瓦州去做一个调查。艾奥瓦州是农业州，人家都说那里猪比人还多，是研究猪霍乱的好地方。肖普来到艾奥瓦州，发现有个问题比猪霍乱更急需研究，就是猪流感。
1918 年之前没人报道过猪流感，但自从科恩在锡达拉皮兹发现这种疾病之后，美国的猪流感就再也没消失，每年都有一些猪出现流感症状。当时中西部有上百万头猪感染，严重的时候，一次流行能让几千头猪死亡。艾奥瓦州既然猪比人多，自然更容易遭灾。
艾奥瓦州的猪
（"The only free pig in Iowa" by In Memoriam: PhillipC is licensed under CC BY 2.0.）
肖普向刘易斯汇报了这个情况。跟科恩一样，他们俩也注意到猪流感跟人流感有很密切的关系，似乎是两个群体在互相传染。如果真的是这样，那么两者很可能是由同一种病原体导致的，这就意味着，研究猪流感或许顺便也能破解人流感的秘密。于是刘易斯同意肖普把研究方向转向猪流感，还具体指导他设计实验，证实自己的假说。
那时候菲佛的流感嗜血杆菌理论依然强劲，他们的第一步也是致力于寻找这种病菌。肖普从病猪的鼻子里采集鼻涕样本，带回实验室用显微镜观察，确实找到了跟人类流感嗜血杆菌非常相似的病菌。但既然这细菌出现在动物身上，或许是一种不同的品种，于是他们把这种病菌命名为猪流感嗜血杆菌。根据当时医学界判定病原体的金标准，也就是科赫法则，接下来肖普应该培养出这种病菌的纯菌株，用这样的纯菌株再次感染猪，如果能导致同样的病症，就说明这个病菌确实是猪流感的病原体。
培养病菌费了点工夫。流感嗜血杆菌非常娇弱，只要培养皿里有其他细菌，那些杂菌必定会把它淹死。好在当年英国的弗莱明（Alexander Fleming，1881–1955）找到一种办法，把青霉素洒在培养皿里，就能杀死其他各种细菌，但流感嗜血杆菌不怕青霉素，就成为培养皿里幸存的一族。肖普用这种办法培养出纯净的猪流感嗜血杆菌，再把含有这种杆菌的混悬液滴进一只健康猪的鼻子里。没想到真的成功了！这只猪真的病了，看起来也像是流感，症状包括流鼻涕和发烧。肖普把猪安乐死之后解剖查看，在肺脏里果然又找到了猪流感嗜血杆菌。这完全符合科赫法则。
青霉素可以帮助培养纯净的猪流感嗜血杆菌
（"The discovery of Penicillin" by Solis Invicti is licensed under CC BY 2.0.）
这样是不是就能说明猪流感的病原体就是这种杆菌了呢？
还不能，因为任何实验都需要满足一个基本要求，就是“可重复性”，一次实验成功是不能下结论的。肖普继续用同样的纯净猪流感嗜血杆菌感染健康猪，但情况改变了，他连续几十次实验，都没能重复第一次的结果，猪没有出现任何症状，解剖也没发现呼吸道有任何病理改变。看来第一次实验能产生流感症状，跟猪流感嗜血杆菌未必有什么关系，倒可能是有其他的病原体混入。
刘易斯只身犯险
肖普退回去一点，不用纯猪流感嗜血杆菌，而是直接用病猪的鼻涕做接种。这个没问题，被接种的猪每次都会发病，发的都是猪流感。他跟刘易斯讨论了一下，这种情况必须考虑其他的可能，比如病毒。
这时候是 1928 年，洛克菲勒研究所的西非黄热病研究中心刚好有重大突破，证实黄热病是由病毒而不是细菌导致的。让问题有点复杂的是，同在洛克菲勒研究所工作的野口英世不认同这个发现。他亲自去到西非的研究中心，用黄热病人体液做实验，试图证明这个病的病因是细菌而不是病毒，没想到实验过程中，他自己染上黄热病去世。野口英世名气很大，许多人为此震动，呼吁洛克菲勒研究所再次核实西非中心的结论。此时为了研究黄热病，洛克菲勒中心已经有好几位一流学者殉职。
继续研究黄热病，有点像去地雷阵做排雷工作，不知道什么时候就可能触发爆炸。二十七岁的肖普年轻气盛，自告奋勇到巴西做这个核实工作，因为那里恰好有黄热病流行。但他的老师刘易斯没同意，说你年纪轻轻，儿子刚刚出生，不适合去冒险。于是刘易斯自己到巴西研究黄热病，让肖普留在普林斯顿继续研究猪流感，并提醒他用过滤法判断猪流感是不是由病毒导致。
黄热病病毒
（"Yellow fever virus (Flavivirus)" by Sanofi Pasteur is licensed under CC BY-NC-ND 2.0.）
1928 年，医学界没有什么设备能直接看到病毒，要区分细菌和病毒，最可靠的办法是用尚贝兰陶滤器。这种滤器孔径非常小，细菌不能穿过，但病毒却可以。根据老师的提议，肖普从病猪鼻子里采集黏液，制作成混悬液之后，用尚贝兰滤器加压过滤，再用得到的澄清液体滴到健康猪的鼻子里。实验不是很顺利，有时候他能制造出实验性猪流感，有时候却什么都没发生。他得不出恒定的结果，就猜想或许在猪身上，必须是病毒和猪流感嗜血杆菌同时出现，才能导致发病。
1929 年 6 月，刘易斯在巴西染上黄热病，最终没能逃脱死神的邀请，成为又一位因研究这种恶性传染病而殉职的学者。肖普现在只能自己继续研究。反复实验了一年多，到 1931 年，他大部分时候能用猪鼻涕的过滤液制造人工感染，但如果用猪鼻涕过滤液加上猪流感嗜血病毒纯菌株同时接种，感染成功率就几乎是 100%。他把结果总结出来，发表了论文。论文里，他认为“可过滤病原体”是猪流感的主要病原体，但猪流感嗜血杆菌似乎有协同作用，让猪更容易感染，感染之后的病理损害也更严重。
为了纪念老师，肖普在这篇论文里，第一作者写的是刘易斯的名字。
“可过滤致病元素”
论文发表之后，有个叫作安德鲁斯的人大感兴趣。
安德鲁斯（Christopher Andrewes）是英国微生物学家，肖普跟猪打交道的那段时间，他在跟狗打交道。
说起来算是机缘巧合。1918 年流感让医学和卫生学专家心情沉重，一直想深入了解这个病，万一类似烈度的流感卷土重来，人们需要知道怎么能更有效地应对。虽然菲佛说流感的病原体是流感嗜血杆菌，但越来越多的人发现，从流感病人的呼吸道里就是找不到这种病菌，包括那些显微镜用得比刀叉还熟练的人都找不到，所以总有人在思考其他的可能，比如“可过滤病原体”，也就是后来被叫作“病毒”的东西。只不过那时没有电子显微镜，看不到病毒，做起研究来就有点瞎子摸象的朦胧。研究病毒的另外一个有力工具是抗体测试，但在 1918 年，这种技术还相当原始，不能用来做精准研究。
所以几年过去，谁都没有实质性进展。为加快研究步伐，1922 年，英国医学研究委员会成立了国立医学研究院，目的是研究“可过滤致病元素”，主持研究的是三位英国医学家，莱德劳（Patrick Laidlaw）、史密斯（Wilson Smith）和安德鲁斯。
光学显微镜看不到病毒
（"My grandfather's microscope" by Juan Eduardo Donoso is licensed under CC BY-NC-ND 2.0.）
当时大家都认为流感是人类特有的疾病，不能用动物制作流感模型，于是只能找一些似乎跟人类流感接近的动物疾病，希望可以给人类流感的研究提供某种启发。莱德劳他们选择的动物疾病是犬瘟。
十八世纪末，英国乡绅时兴的娱乐之一是猎狐。猎狐离不开猎犬，但猎犬怕犬瘟。十九世纪初，英国频频暴发犬瘟，这是一种呼吸道感染，很多猎犬因此死亡。兽医们曾经研究过犬瘟，都说找不到病菌，那么这很可能是一种“可过滤致病元素”导致的。病原体可过滤，感染又发生在呼吸道，这就跟流感有足够多的共性。
猎狐爱好者听说有国立机构的医学专家研究犬瘟，大喜过望。玩猎狐的都挺有钱，他们就筹集资金，让国立医学研究院在磨坊山（Mill Hill）买下一处占地四十英亩的废弃农场，改建成一个研究所，让莱德劳、史密斯和安德鲁斯在那里开展研究。
没多久，一些爱狗人士对研究院用狗做实验渐渐有些不满，说这对狗太残忍了。好在那些热衷养狗的乡绅有时候也养一些其他动物，比如雪貂。其中一位乡绅跑来告诉莱德劳他们，说他发现雪貂也会感染犬瘟。莱德劳小组试了试，还真是这样，那以后他们就改用雪貂做研究。雪貂比狗繁殖得快，感染之后症状更明显，而且雪貂关在笼子里的时候不急不躁，自己玩得很开心，饲养工作也就容易一些。这让研究人员高兴，而爱狗人士也不再提出抗议，阴云就此散去。
雪貂
（来源：Depositphotos，已获授权）
1927 年，国立医学研究院研发出犬瘟疫苗，效果良好，猎狐爱好者们很满意。
犬瘟问题解决了，莱德劳等人的工作并没结束，因为他们要解决的是人类流感。犬瘟疫苗有效，说明他们研究的这个“可过滤病原体”确实存在，只不过当时的显微镜看不到。但只要知道它们确实存在，就可以用它们做各种实验，寻找规律，而找到的规律或许能帮助破解人类流感的秘密。于是他们就继续让雪貂感染犬瘟，继续观察它们的病情变化，继续做解剖，研究病死雪貂的器官改变。
1931 年，研究院的安德鲁斯看到了肖普那篇论文，说人类流感暴发期间，当地的猪也会暴发一种看起来很像流感的病，而肖普用实验证实，这些病猪的呼吸道里有“可过滤病原体”。这让安德鲁斯很有了些想法：如果猪流感跟人流感真的由同一种病原体导致，从这里下手研究，就很可能解开人类流感的秘密。
雪貂再立大功
安德鲁斯立即给肖普写信询问细节，后来还到美国参观肖普的实验室。见面之后两人感觉很谈得来，从此成为挚友。肖普工作之余带着安德鲁斯到自己小时候常去的湖边钓鱼、打猎，安德鲁斯观摩肖普的实验过程。访问结束之后，安德鲁斯带着新知识和新技术回到磨坊山，向莱德劳提出建议。根据肖普的实验结果，猪感染的可能就是人类流感病原体，但用猪做实验实在很不方便，成本也太高。他们想，既然猪可以感染，或许其他动物也有可以感染的？
猪流感病毒
（"Swine Flu Virus Particles" by NIAID is licensed under CC BY 2.0.）
于是他们重新开始扫描。那是 1933 年，恰好伦敦有一场小型流感暴发，他们从病人鼻咽部采集分泌物，做成混悬液，给各种常用的实验动物滴鼻子，小鼠、大鼠、白鼠、猴子、马，甚至猪也尝试了，但奇怪的是，都不能制造感染。
到底是肖普的实验有错误，还是自己没掌握技术？
他们没泄气，继续尝试。起初他们没尝试雪貂，因为通常实验室里没人用这个，他们是研究犬瘟的时候，为避免爱狗人士的抗议，不得已才用雪貂做替代品，回到人类疾病，最先尝试的还是那些“标准”实验室动物。但所有常用动物都失败，有一天安德鲁斯就想，何不也试试雪貂？
2 月间，安德鲁斯自己也患上了流感，就用蒸馏水含漱，这样应该可以捕捉到咽喉里的病原体。史密斯把这种含漱液放进尚贝兰陶滤器过滤，再将滤液滴进两只雪貂的鼻子里。接下来需要等待几天，看看雪貂是不是出现症状。没想到两只雪貂夜里拱开笼门，逃得无影无踪。实验告吹。
3 月 4 日，史密斯也患上了流感。现在他跟安德鲁斯角色对调，他提供含漱液，安德鲁斯去给雪貂接种。这次他们加强了防范，没再发生逃逸事件。两天之后，被接种的雪貂出现症状：发烧，打喷嚏，流鼻涕，眼泪汪汪，神情委顿。所有症状都符合流感的诊断标准。
更重要的是，这个实验可以重复。显然雪貂对流感病毒很敏感，不但接种可以让它们感染，如果让感染的雪貂跟健康雪貂住在同一个笼子里，健康雪貂肯定也会被感染。
作为感染源的滤液，就是史密斯的含漱液，是经过陶滤器过滤的，里面不可能有细菌。这就只有一个结论：病原体是病毒，不是细菌。
不过，按照科赫法则，要证明这种病毒确实是导致人类流感的病毒，而不仅仅只是让雪貂生病，就还有一步实验需要做：从感染动物里提取病毒，用来感染人。
三个研究人员从雪貂鼻子里取来鼻涕，做成混悬液，滴进自己的鼻子里，等待发病。
但三人都没发病。
这时候对病毒的研究刚刚起步，有太多的细节需要探索，从动物回头感染人类不成功，他们就暂时放下这个课题，先研究其他内容。
第一百九十七名感染者
最重要的课题是，必须确认只有过滤的鼻涕能导致这样的感染。没过滤的雪貂鼻涕有很多细菌，为了迎战可能出现的质疑，他们把所有找到的细菌，包括菲佛的流感嗜血杆菌，逐个分离培养，得到纯净的菌株，然后用这些菌株滴入健康雪貂的鼻子。但没有任何细菌可以让雪貂出现流感症状，连流感嗜血杆菌都不行。这就进一步证明，造成感染的不是细菌，而是那个可过滤病毒。
接下来，他们要研究具体的感染过程，包括雪貂感染之后的病程长短、病死率高低；如果雪貂病死，身体器官有哪些病理损害，如果康复，血清里是不是产生了抗病毒抗体。
最后这一点很重要。他们确实发现，感染这种流感的雪貂如果康复了，血清里会出现抗体。那时候还没有足够准确的提纯技术，他们测试抗体的方法相当原始，首先从一只处于流感症状高峰的雪貂鼻子里采集鼻涕，这种鼻涕如果直接滴进健康雪貂的鼻子，肯定能制造感染，但如果用康复雪貂的血清跟这种鼻涕混合，再滴入健康雪貂的鼻子，雪貂则不会被感染。这说明康复雪貂的血清有抗体，能杀死患病雪貂鼻涕里的病毒。
方法很古朴，但有效，而且相当可靠。这样的客观检测技术对后来的流感研究大有帮助。比如，当时史密斯已经康复，那么他的血清应该有针对这个流感毒株的抗体。他就把自己的血清跟实验室感染雪貂的鼻涕混合，这么处理之后，这种鼻涕就不再能感染健康雪貂。这进一步说明，雪貂感染的确实就是来自史密斯体内的那种病毒。
那时候已经发现，病毒不能用培养皿来培养繁殖，要保持这个病毒“火种”，唯一的办法就是不断让发病的雪貂感染下一只雪貂，借助雪貂的身体做培养皿，术语叫“传代”。所以他们需要不停地做这种传代接种。
世界流感中心发布的纪念邮票，上面印有雪貂
（"039-Influenza" by nimrlondon is licensed under CC BY 2.0.）
1936 年 3 月 6 日，在研究院实习的哈利斯（CharlesStuart-Harris）到地下室的饲养区，给做了传代接种的雪貂检查身体。一个隔间里有六只雪貂，都已经被人工制造感染。哈利斯给它们查体温，记录各种症状，采集鼻涕和口腔黏液做标本。他抓起一只雪貂采集鼻涕的时候，那雪貂忽然打了个喷嚏，一团飞沫直接落到他的脸上。
四十五个小时之后，哈利斯开始发烧，然后出现全套流感症状。
无意之中，他完成了科赫法则要求的最后一步：人工制造的感染动物，体内的病原体能重新感染人类，导致同样的疾病。
对于病毒，这就已经是足够完整的证据链。哈利斯用自己的健康做代价，提供了证据链的最后一环，证明流感是由“可过滤病毒”导致的。
从最早用史密斯的鼻涕感染的第一只雪貂开始，莱德劳他们就一直做传代感染，保持火种。对着哈利斯打喷嚏的那只雪貂是第一百九十六只，哈利斯一不小心插队进入这个系列，成为第一百九十七名感染者。
所有这些感染都源于史密斯的鼻涕，感染源都是同一个病毒的后代。这病毒株世代流传，到现在依然保存在世界各地的流感研究实验室里，毒株的名字就是史密斯名字的缩写：W. S. 。他们三人都曾经被同样的毒株感染过，体内已经有抗体，这些抗体对本毒株的有效性基本上可以保持终身，再用同一种毒株给自己做接种，当然不会发病。哈利斯是新来的，他或许曾经感染过其他毒株的流感，但肯定没接触过史密斯毒株，所以他能被感染。
- 未完待续 -
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