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上一篇 复活 1918 年流感病毒 我们说到，赫尔廷成功找到了被埋在阿拉斯加永久冻土中的流感病死者样本，但这些样本中的病毒都已经失去了活性，他没能在实验室中复活 1918 年流感病毒。本文内容来自读库文库本系列《人类与病》，已获得读库授权
陶本伯格（Jeffery Taubenberger）的身份是美国武装部队病理研究所的实验室主任，但是看起来不太像个主任，因为他长着一张娃娃脸，三十多岁了却常年穿一条灯芯绒裤子，传统的大学生风格。所以，他老是被新来的人误以为是个实习生。
他不爱交际，熟悉他的人不多。实验室的位置更是让他像个隐居闹市的神秘人物。他的实验室藏在一幢五层混凝土大楼里，跟周遭建筑相比，一看就是个异类。美国大多数房子都是钢架木墙，这幢楼是二十世纪五十年代冷战时期建的，既然属于武装部队，就有可能被人用炸弹炸，所以设计标准是能防御原子弹，混凝土整体浇筑的墙壁足足有一米半厚。本来那片地方所有的建筑都要按这个标准修建，没想到第一幢楼刚修好，苏联宣布氢弹试爆成功，而这种建筑没法抵御氢弹的中子流，于是管理部门放弃了后期的水泥建筑计划，但这幢楼也没费事拆除，就留下来充作传染病研究实验室。陶本伯格个人生活低调，连办公室也足够低调，里面的家具样式陈旧，灰头土脸，因为那都是捡来的。这个楼位于院子偏僻角落，外面有个货运通道，别的办公室就把淘汰的桌椅扔到那里，等待垃圾公司来拖走。陶本伯格懒得写报告申请家具，需要什么就到那里去捡，就这么凑齐了一个办公室需要的行头。屋子里所有能堆放东西的平面都堆满了书籍和期刊，所有能贴东西的平面都贴着花花绿绿的便利贴，上面是各种日程提醒，也不知道他是不是真的能记住所有这些提醒。通常来说，年轻人上大学，只要有可能都会尽量选名校，入学之后尽量拓展人脉，最好能跟名教授建立个人关系，然后做研究生，做博士后。这被认为是学术飞升的快车道，但陶本伯格对快车道兴趣平平。高中的时候他觉得校园生活沉闷，很想早日摆脱。他家在弗吉尼亚的费尔法克斯县，那里有个乔治梅森大学，高中没毕业的人也可以到那里读预科，修到的是完全有效的学分，实际上等于提前开始大学课程，于是十五岁的陶本伯格就去那里读书，选择的方向是生物学。暑假期间，大学生普遍的做法是找暑期工，积攒经验。说到生物学，那片地方最有名的是美国国立卫生研究院，陶本伯格在研究院的一个实验室找到一份暑期工，跟着世界级的生物学家研究肿瘤病毒。生物学的奥秘让他着迷，他想在乔治梅森大学拿到一个生物学博士就开始工作，但老师跟他说，你有天分，如果愿意在生物学领域工作，会有成就，但要想做得好，最好能同时有生物学博士和医学博士。陶本伯格从善如流，立即申请医学博士课程，而且顺利被录取。他拿出本事，两段学业的课程密切穿插，同步进行，1986 年拿到医学博士， 1987 年拿到生物学博士。学位有了，现在需要找个工作。也是他运气好，国立卫生研究院下属的癌症研究所刚好有三个病理科住院医师培训空额，虽然竞争很激烈，但陶本伯格毕竟曾经在卫生研究院见习，指导老师的评语都很给力，加上有双博士学位，居然就拿到了这个职位。然后凭着优秀表现，1993 年成为全职雇员，拿到的第一个项目是跟着一位资深病理学家做助手，为武装部队病理研究所建立传染病实验室，地点就在那个碉堡一般坚固的混凝土五层楼。一年之后，他被提升为实验室主任。最初，陶本伯格的研究课题是承接自己的博士研究内容，寻找乳腺癌的病因。那段时间，医学界许多大腕认为癌症是由病毒引起的，所以陶本伯格的研究焦点落在病毒身上，实验室部署的设备和技术都围绕病毒分析，包括凝胶电泳、荧光染色、聚合酶链反应技术等等。这些技术在当时属于尖端，不是每个实验室都有条件部署。有一次，一个研究海洋生物的学者来找陶本伯格帮忙。那位专家发现最近频繁有海豚死在海滩上，怀疑是某种病毒，但他自己没有条件做分析，就想请陶本伯格他们试试能不能从海豚尸体里找到特殊的病毒。
陶本伯格觉得海豚都死了，机体开始腐烂，腐烂主要是细菌吞食有机物导致的，一旦腐烂开始，必定有大量细菌繁殖，就算曾经有病毒感染，也会被细菌的汪洋大海给淹没，几乎不可能把里面的病毒成分给分离出来。但人家提出来了，那就姑且试试吧，他让实验室里负责病毒分析的克拉夫特（Amy Krafft）和瑞德（Ann Reid）做。没想到居然真的找到一种肇事病毒，那是人类麻疹病毒的一个近亲，但只感染海洋动物，就是这种病毒导致海豚的死亡，这让海洋环境部门对于治理措施有了明确的思路。陶本伯格对这次研究的结果挺满意。
1995 年，陶本伯格的实验室经费被削减，他们需要调整方向，找一些花钱不多，又能让实验室的硬件和软件有用武之地的课题。具体做什么，他一时没主意，就让大家坐下来随便提建议。各种建议都有，但都没能让陶本伯格动心。这话似乎触到了一个开关，几乎所有的人都产生感应，不用问就能看出，大家一致认为这是个好课题。只有一个问题，当时“专业”研究流感的人很多，几十年了都没重大突破，陶本伯格小组从来没染指流感病毒，这时候来插手，有点像是圈外人要跟专业人员叫板。但有两件事让陶本伯格觉得值得一试：第一，自己的实验室有最先进的设备，而要说病毒分析，克拉夫特和瑞德称得上是技术精纯。只要能得到某个 1918 年流感死者肺脏的一点点样本，凭借团队的技术实力，就有可能把病毒的基因给挖出来。第二个理由是样本来源。从哪里得到当年死者的组织样本，一般人不会知道，陶本伯格既然在武装部队病理研究所工作，他就有了一个隐秘的信息，那就是当年林肯下令修建的那个病理标本档案库。陶本伯格的推测是，如果 1918 年有美国军人死于流感，这个档案库就必定保存了样本。不过，他需要的是肺部组织样本，流感病毒可能出现在身体各处，但只有出现在肺脏的毒株，才可能有 1918 年流感这么猛烈的毒性。那些死于流感的士兵，都留下了肺脏标本吗？他不敢确定。当时每天都有许多人死去，压力巨大，而那些做尸体解剖的军医，专长是战伤急救，“应该保留肺脏标本”这样的病理学知识，他们未必具备。但死于那次流感的军人数以万计，总该有一部分军医想到保留肺脏组织，这就值得去查一下。反正这个档案库就在自己实验室旁边，打开窗户大叫一声对方都能听到。还有一个问题，这些样本预先都用福尔马林浸泡，这可以防止有机物腐败，术语叫作“固定”。福尔马林会破坏大部分遗传物质，所以陶本伯格交代实验室成员低调行事，别对外人提到这个项目。但他也不觉得自己是在浪费时间，他想，克拉夫特她们能从高度腐烂的海豚组织里挖出类麻疹海豚病毒，自然也有可能从福尔马林处理过的流感病人肺脏组织里挖出流感病毒。现在需要思考怎么找到最有希望的样本。他知道档案库有三百万份样本，如果 1918 年死于流感的士兵确实都保留了样本，那么必定会有许多份，他决定找出那些发病之后几天就死亡的病例——他知道，发病时间一长，很多人会并发细菌性肺炎，一旦细菌感染弥漫到整个肺部，寻找病毒就困难得多，只有发病一周之内死亡的病例，病毒的足迹或许还没被完全淹没。二十世纪九十年代中期，美国科研机构的数据已经高度电子化，陶本伯格向档案库提出需求之后，不到两天就收到一份计算机打印的查询结果。根据查询，三百多万份样本里有七十份跟 1918 年流感有关，样本是肺组织团块，每个样本都附有来源病人的病历。这让陶本伯格很快就筛选出六个病例，这六个人都是在发病后一周之内死亡。陶本伯格本来心里忐忑，不确定是不是能找到符合他心目中标准的病例，没想到一下能找到六个，有点意外中彩的激动。
1995 年 3 月 19 日，他们拿到六份样本，正式开始分析。样本都经过福尔马林浸泡，包裹在石蜡里。从这种封禁了将近八十年的人体组织里提取某种分子成分，需要非常细致的操作，这方面，实验室里的瑞德是行家。那时候还没有专用的切削设备，她用一把高品质剃须刀片，手工从这些组织团块上削下一层层薄片，薄得透明，“大约只有一个细胞的厚度”，一张切片大约有两千个细胞。这些细胞里或许就隐藏着1918年流感的病毒，但要找到它们，需要清除所有其他不相干的成分。
第一次世界大战士兵罗斯科 · 沃恩的微型载玻片和石蜡包埋肺组织样本
瑞德先用二甲苯洗掉表层的石蜡，然后用离心机把含有石蜡的二甲苯跟其他组织碎片分离。沉淀下来的组织碎片用乙醇清洗，这可以去掉残余的二甲苯，而乙醇本身很快就挥发消散。现在留在她试管里的是一堆细胞碎片，有各种脂质和蛋白质，还有核酸，也就是遗传物质。有核酸不奇怪，每个生物细胞里都有DNA，全名脱氧核糖核酸。陶本伯格团队的期望是，这些细胞碎片里不仅有人体细胞自己的核酸（DNA），还有一些 1918 年流感病毒的核酸 （RNA）：所有病毒都必须进入人体细胞才能繁殖，如果被感染的人死亡，这些病毒的RNA也就一同被埋在了细胞里。瑞德的工作，就是想办法把病毒核酸从这堆组织杂拌里给挖出来。她往试管里加入生理盐水，再加入一点蛋白酶K，这种酶可以切碎蛋白质。另外她又加入一些洗涤剂，这可以溶解掉脂肪构成的细胞膜。几个小时之后，她往试管里加入氯仿和苯酚混合试剂，摇动一下试管。现在试管里的液体分成了两层，一层是油性的，一层是水性的。经过这些处理，核酸已经从组织杂拌里游离出来，漂浮在水性溶液里，留在油性溶液里的是其他组织碎片。油比水轻，会浮在上层。瑞德把上层的油性溶液去掉，剩下的薄薄一层水溶液里含有核酸。加入一些乙醇，再次用离心机甩一下，让核酸分子沉淀到试管底部。去掉上层的溶液，得到的就是核酸聚成的小颗粒。
核酸机中的微离心管
如果一个普通百姓站在瑞德身旁看她做这些操作，肯定会觉得非常诧异。从第一步到最后一步，她那些试管里的样本液体，以及她添加的各种试剂，都是清澈透明的，看不出有任何可以让人把玩的宝贝。在旁人看来，她就是把一些清水从一支试管倒进另一支试管，然后就可以去领工资了。瑞德当然不是靠玩清水拿工资，如果说前期准备工作有点像玩水，接下来的操作就有些像变魔术了。她已经分离出一小撮核酸颗粒，但这里面几乎全部都是人体细胞的核酸，如果真有 1918 年流感病毒的核酸，也只是混居其间的一点点外来户。另外，陶本伯格选择病程不足六天的病例，是根据一般病理学来推测，这样的病例，合并细菌感染的可能性不大。不大，但不能说完全没有，如果合并了细菌感染，那么这堆核酸颗粒里也会混杂着细菌的核酸。这么一个混乱局面，怎么才能把其中的 1918 年流感病毒核酸挑出来？
要理解分子探针怎么“钓”出目标核酸，我们可以把瑞德手里那一小撮核酸比作一口鱼塘，把不同的核酸比作不同的鱼，比如，人类的核酸是鲤鱼，细菌的核酸是鲫鱼，病毒的核酸是泥鳅。而这些核酸“鱼”有强烈的结对爱好，若是一条雄鲫鱼遇到一条雌鲫鱼，必定会一把抱住不撒手。鱼塘里的鱼当然不会有这么浪漫的情怀，但核酸“鱼”的癖好跟这倒是差不多。天然核酸的基本成分就是四种碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）。四种碱基按不同顺序排列，就构成了不同的遗传密码。一个个碱基衔接起来，如同串珠，这些碱基串珠有个天然倾向，就是寻找对象组成双股链。双股链的碱基两两相对，互相用化学键勾搭在一起，但并不是随便两个碱基就可以搭上，它们对伴侣的选择很讲究，A永远只跟T对接，G永远只跟C对接。比如一段双股碱基链的快照可以是这样：
DNA 分子结构
上下两股里，A必定跟T结伴，G必定跟C结伴，这遵守的是所谓克里克“中心法则”。因为碱基对之间的这种天然吸引力，如果一个核酸“鱼塘”里，某条“鱼”有六个碱基：GTTCCT，瑞德要想把这条鱼钓出来，就需要做出这么一段碱基片段：CAAGGA。这个片段里，每一个碱基都跟那条“鱼”的碱基对应——按照克里克“中心法则”对应，也就是说，这两段碱基链是互补的。互补的碱基链一旦相遇，就立刻互相贴在一起，生物学上叫作“绑定”。那么对于 GTTCCT 这条碱基“鱼”，CAAGGA 就可以比作鱼钩。根据这个原理，瑞德首先需要知道 1918 年流感病毒的基因内容，也就是这些基因的碱基序列。这个知道了，才可能设计出互补的鱼钩。可是，1918 年流感病毒谁都没见过，怎么知道它的基因内容？1918 年的流感病毒或许已经消失，但其他流感病毒依然每年都出现。1995 年，基因分析技术已经很发达，学者们对所有季节性流行的病毒毒株都做了测序，知道它们的全套基因内容。诚然，流感病毒会变异，每年都有新毒株出现，每个新毒株的基因内容都稍有变化，但变化都是发生在外壳，外壳下面，紧贴着病毒遗传物质（RNA），有一层东西叫作基质蛋白。这东西的目的是包住RNA，不让它们乱跑。对于打算研究病毒的学者，这层基质蛋白还有个很不错的特点：稳定。各种流感病毒的毒株，外壳蛋白可以千变万化，但基质蛋白，包括打印它的基因，一直都没改变，稳定性非常之高，所以陶本伯格和瑞德都很确定：1918 年流感病毒的基质蛋白基因，跟后来所有其他流感毒株都一样。知道这一点，就可以把 1918 年流感病毒基质蛋白基因当作目标，也就是需要钓的碱基“鱼”。倘若瑞德真的能从手头这点核酸颗粒里“钓到”基质蛋白基因，这就是明确证据，证明这段基因不是人类细胞基因，也不是细菌基因，而是病毒基因。这位病人既然死于 1918 年流感，这个病毒当然就只能是 1918 年流感病毒。如果真的能找到这样一段基因，它前后延伸出去的基因必定都是同一个病毒的。能延伸多长，看运气。可能只残存几十个碱基，但运气好的话，说不定整条病毒基因都能一起拖出来。目标确定了。负责打印流感病毒基质蛋白的基因就是瑞德需要钓的“鱼”，那么，互补基因序列，也就是对应的鱼钩（分子探针），该怎么做？不用自己做。1996 年，这种事早就有专业公司在做。需要钓什么样的碱基“鱼”，就把这条“鱼”的原始碱基序列（比如“……GTTCCT……”）发送给这些公司，他们只需要几个小时就可以做好对应的互补碱基序列，让快递公司寄过来。瑞德从病毒文库里检索出流感病毒基质蛋白的那段基因，把它发给艾奥瓦州一家叫作“DNA 整合科技”的公司，几天之后就收到了快递，一个试管里有少许白色的粉末。这就是互补碱基链的干粉，也就是瑞德需要的分子探针。假如瑞德手里那些核酸颗粒里有流感病毒，病毒基因就会跟这些探针绑定。不过，如果各种基因都混在一起，就算有基质蛋白基因（“鱼”）跟分子探针（“鱼钩”）发生了绑定，也难以观察到，就好像一池子的小杂鱼，想找到其中两条抱在一起的，并不是太容易。要寻找这对鱼，最好是能把所有这些鱼给分散开，想判断是不是有目标绑定，瑞德也需要做类似的事，就是把不同品种的基因片段分散开。这个事，凝胶电泳技术可以帮忙。凝胶电泳系统
不过，分子探针既然是分子，肉眼看不见，瑞德怎么知道是不是发生了绑定？这是分子实验室里另一个很有用的技术。瑞德拿到订购的分子探针之后，会先用带射线的物质（比如磷–32 同位素）处理，探针上的放射性物质会让胶片感光，出现一些黑色条纹。
含有遗传片段的测序凝胶和用于定位片段以便进一步分析的曝光的 X 射线平板
分子探针能产生的射线剂量很低，需要在暗房放置一夜才能看到结果。瑞德一晚上睡不踏实，第二天一早就跑到实验室，把感光胶片做显影、定影处理，然后放到阅片灯上查看。
她肯定这不是自己操作错误，更不是所采用的技术不灵。在这个圈子里浸淫了这么多年，她知道分子探针技术的可靠，也知道自己在这个领域的技艺不会输给天下任何一位专家。当然，她跟陶本伯格都知道，学术研究里，这样的失败是常态，没人会因为这点挫败就放弃。她继续尝试，继续捏着剃须刀片，从样本里切削薄片。她知道这些样本有多珍贵——这可能是地球上最后残留的 1918 年流感病毒样本（如果里面真的有病毒样本）。她极其小心地切削，一点碎片都不敢浪费。
偶尔的失败可能是运气不好，一年都没有成功，那就必须思考一下，是不是有方向错误。陶本伯格坐下来跟瑞德研究了一番，认为应该先退一步，从一个确实存在的病毒开始，试试看这套实验方法是不是真的可以钓出目标基因。为增加实验的含金量，他们选择了 1957 年的流感毒株。那场流感没有 1918 年流感那么凶猛，但也造成六万美国人死亡，毒性高于一般的季节性流感。这个毒株的全套基因序列已经探明，而那六万死于流感的美国人里必定有军人，而按照陆军惯例，也会从这些死亡军人体内留取组织标本。只要从武装部队病理研究院档案库拿到这样的标本，重复瑞德的实验，就可以做比照。倘若能钓出目标基因，说明瑞德的实验方法可行，也在一定程度上验证了档案库存储条件的可靠性。从 1957 年到 1996 年，将近四十年过去了，如果一份组织样本保存四十年之后能钓出病毒基因，从理论上说，挖掘 191 8年的病毒基因也应该可以。档案库确实有 1957 年的流感死者标本，同样是裹在石蜡里的肺叶组织。慎重起见，瑞德把实验室另一位组织分析专家卡拉夫特请来一起攻关。当初从海豚里提取出类麻疹病毒，卡拉夫特是主力，她能从腐烂的海豚组织里挖出病毒，那么现在要处理多年固定的组织，或许会有一些独特技巧。卡拉夫特从档案库拿到 1957 年的组织样本，使出所有她能想到的招数，精准分离出里面的核酸，然后瑞德接手，用分子探针“钓鱼”。分子探针冲洗完成之后，她到暗室把感光胶片跟“钓鱼”的薄膜叠加放好，让胶片感光。第二天一早六点半，瑞德急匆匆跑进暗室，拿出胶片冲洗，然后带进实验室查看。十五个月，她天天看到的都是一张空白胶片，陡然出现这么个条纹，她愣住了，吃不准自己看到的是什么。她冲进陶本伯格的办公室，把胶片举在脸前，说：“你帮我看看，我是不是有幻觉？”陶本伯格跟她一样激动，但马上提醒她要冷静。这应该是分子探针绑定了东西，但绑定的是 1957 年病毒，还是别的污染，必须核实。你检查一下这段基因的真实内容。
陶本伯格与瑞德
瑞德给这段从四十年前的标本钓出来的基因做测序。她看到的是个残片，只有七十个碱基，这是一般流感病毒基因的二十分之一。瑞德进入美国国家医学图书馆网站，打开一个叫作 BLAST 的应用程序。这个程序可以把输入的基因序列跟已知的基因序列做对比，给出鉴别意见。瑞德把自己测出来的那段基因序列输入，BLAST 立即给出了答案：跟 1957 年流感病毒的基质蛋白基因完全吻合。瑞德第一反应是放心，因为她现在确信自己的操作肯定没问题了，接着又觉得有点失落：测出来的是 1957 年的流感病毒，而他们的梦想是找到 1918 年的流感病毒基因，两者不是一回事。但陶本伯格很振奋，对瑞德说，既然我们能钓出保存四十年的病毒基因，凭什么不能钓出保存八十年的？那六份 1918 年的标本还没测完，我们继续！他们回到实验室，拿起下一盒标本。标本盒上有死者的信息卡。死者名叫沃恩，二十一岁，1918 年 9 月 26 日早上六点半死亡。陶本伯格打开盒子，拿出里面的两团标本，这分别是沃恩左侧和右侧肺叶取来的样本。两个样本用肉眼就可以看出有明显不同，左肺因为细菌感染有明显的渗血点和脓点，右肺则被清澈的液体淹没。这让陶本伯格有一个直觉，觉得沃恩右肺的组织里很可能还有残存的病毒，因为这里完全没有受到细菌的干扰。克拉夫特小心翼翼地从沃恩的右肺样本里削出一层薄片，粉碎，溶解，沉淀分离，然后瑞德用分子探针去冲刷，曝光，冲洗，查看。是什么病毒？BLAST 的文库里没有 1918 年流感病毒的序列，不能靠那个做鉴别。但沃恩 1918 年死于流感，找到的这段基因又是一成不变的流感病毒基质蛋白基因，那么这个病毒没别的可能，只能是 1918 年流感病毒。当年在军营里负责做尸体检查的军医赫格佛斯，给沃恩肺脏组织保留样本，只是在尽一份责任，以后这些样本会怎样，他没多想。若是他泉下有知，七十八年之后看到陶本伯格这个研究发现，想必也会有一种欣慰。既然有基质蛋白基因，就应该有其他的基因。这个时候，依靠对其他季节性流感病毒的研究，医学界对这种病毒基因的总体结构已经有很深入的了解，知道一个流感病毒会含有哪些基因。根据这些资料，瑞德订购了不同的分子探针，分别去钓各个基因。新发现接踵而来。神经氨酸酶基因、核蛋白基因、Ⅰ型和Ⅱ型基质蛋白基因都找到了。
显示流感病毒基因序列的曝光 X 射线
到这时，瑞德已经连续工作了一年半。研究既然已经有突破，陶本伯格就让瑞德去休假，自己接手分析。卡拉夫特协助他制备核酸纯颗粒，他做分子探针匹配。他们从沃恩的标本里又找到血凝素，这是流感病毒能入侵人体细胞的关键蛋白。
沃恩的标本挖到了头，再也钓不出新的基因片段。陶本伯格转向其他的标本。一份标本来自唐斯（James Downs），是一名三十岁的军人，1918 年在纽约一个军营染上流感，跟沃恩同一天死亡。从唐斯留下的标本里又找到一部分 1918 年流感病毒残片。这是最后一批收获，剩下的标本再没能提供新的基因残片。毕竟经过福尔马林浸泡，这些基因都是残片，只有部分信息，但比起一无所知，已经是非常重大的进展。
根据这些基因片段，他们可以确定，1918 年病毒跟当时在猪群依然流行的病毒属于同一类型，都是 H1N1 病毒。这为当年肖普的发现提供了最有力的证词。
他们的论文 1997 年 3 月在《科学》杂志发表。陶本伯格一夜之间成为名人，“电话铃响个不停，八十个人想采访我……”他自己并不觉得有多么兴奋，他想挖掘出完整的 1918 年流感病毒基因。可惜，再也找不到别的标本。1997 年 7 月的某一天，陶本伯格休假回到办公室，看到了桌上堆积如山的信件。大多数信件是日常公务往来，但是，当他翻开其中一封信时，陶本伯格当场愣在原地，惊呼一声。
