最新发现！挖到可发微生物高分SCI的宝藏技术了

最近小编在浏览文献时，发现Nature Communications新增了一篇单细菌转录组研究的方法学文章——《Droplet-based high-throughput single microbe RNA sequencing by smRandom-seq》，来自浙大王永成团队与哈佛大学实验室。

大家都知道，这几年单细胞技术有多火，但受到之前工具的限制，只能在新鲜样本单细胞研究领域卷生卷死。这两年，一些新的技术涌现之后，可以对FFPE样本、微生物进行单细胞检测。我们公众号之前就发过一篇FFPE样本高通量单细胞的SCI解读，没想到微生物的转录组研究也这么快发表了。

细菌单细胞研究层面，由于裂解困难、RNA上poly(A)的缺失以及核酸含量低等原因，单细菌转录研究成果相对缺乏，这也是为什么小编看到这篇文章之后，快马加鞭给大家解读了出来。这么好的发SCI的机会，得赶紧让大家了解一下这个新技术。

smRandom-seq的工作流程如图1所示。首先使用4%多聚甲醛固定细菌过夜，以交联细菌内部的RNA、DNA和蛋白质。然后对固定的细菌进行透化，以便进行下一步原位逆转录反应。接着加入随机引物与细菌内的RNA结合扩增总RNA。通过末端转移酶（TdT）将poly（dA）尾巴原位添加到cDNA的3’端。使用微流控装置将单个细菌与标记微珠封装到液滴中；通过酶切将poly(T)引物从微珠上释放出来，同时将cDNA从细菌中释放出来。poly (T)引物与cDNA末端的poly (A)尾结合，随后延伸给cDNA加上特定标签，并给每个cDNA上添加分子标签（UMI）。破乳对标记cDNA进行扩增。

smRandom-seq与我们之前介绍的snRandom-seq技术路线基本类似，展示了随机引物原理在真核及原核领域开展单细胞研究的可行性。根据文章描述，作者使用了国内单细胞测序公司M20 Genomics自主研发的商业化试剂平台，这对大家是一个利好啊，试剂可及，成本可控。

图1. 基于液滴法的smRandom-seq的概述。

使用smRandom-seq对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的混合样本进行检测，以评估文库的纯度（图2a）。smRandom-seq的双胞率较低（1.6%），物种特异性较高（枯草芽孢杆菌99.6%；大肠杆菌98.4%）（图2b）。此外，还进行了鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌的三菌混合smRandom-seq实验。UMAP分析显示三个物种分别聚类（图3），三菌混合的双胞率为2.8%。对常见的临床致病菌进行检测以确认smRandom-seq的普适性，smRandom-seq方法在这些细菌中表现出了良好的性能（图2c）。转录本覆盖度如图4，从5’-3’均有较高覆盖。

作者通过CRISPR/Cas9消减rRNA衍生的cDNA。消减后rRNA比例从83%降到32%（图2d）。rRNA消减后大肠杆菌的基因中位值有所提升（图2e），且消减前后基因表达相关性较高（图2f）。作者对其他细菌物种也进行了基于Cas-9的rRNA消减，包括鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，以及鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌三菌混合样本。rRNA比例从70%-90%降低为4%-45%，证明了该方法的广泛适用性。饱和度分析表明，每个细菌唯一比对序列超过10K序列，细菌基因中位值仍在持续增加；在~20K mapped reads per bacterium的情况下，细菌中位基因数可达1000（图2h）。

图2. smRandom-seq性能检测

图3. 三菌混合检测

图4. 转录本的平均覆盖率（5’->3’）

PETRI-seq和microSPLiT是之前在nature microbiology和Science上发表的2种细菌scRNA-seq方法，使用随机引物进行逆转录及分裂池标记策略，同时对成千上万固定细菌同时进行检测；在大规模研究细菌群落异质性上有了很大的进步。但组合分裂池标记策略需要在96孔板中进行多次反应，并不是高通量scRNA-seq的合适平台，且检测到的基因数也并不是非常高。相较之下，smRandom-seq方法的性能远远优于PETRI-seq和microSPLiT（表1）。

表1 平台检测数据对比

使用12.5 μg/mL氨苄西林（AMP）处理指数期大肠杆菌，发现大肠杆菌形态的异质性逐渐增加（图5a）。对处理0、1、2和4小时的大肠杆菌进行了smRandom-seq检测。AMP处理导致基因表达模式发生显著变化（图5b），处理后的细菌显示出了不同的亚群,亚群主要来自2h时间点（亚群2、5、8）和4h时间点（亚群6、9、10），亚群间因表达模式相关性较低，这说明随着暴露AMP时间的推移，细菌的基因表达模式存在差异（图5c、d）。作者确定每个亚群前5的差异表达基因（DEGs），以进一步了解大肠杆菌AMP处理后的异质性。选择与抗生素反应相关的DEGs来代表每个亚群（图5e）。

下一步研究每个细菌在低维空间中的表达特征（图5f-l）。0h时间点，甘油有氧发酵相关基因（glpD和glpK）特异性高表达（0号、7号亚群）。1h时间点，普遍高表达编码乙醛酸支路酶的基因（aceA和aceB）（1号、3号、4号亚群）。在AMP处理2小时后，大肠杆菌各亚群经历了不同程度的膜完整性和翻译损伤；8号、2号、5号亚群分别显著表达osmY和degP（细菌抗胁迫相关）、fusA（大肠杆菌翻译系统氧化损伤过程中的关键靶点）、ssrA（翻译蛋白质质量控制）。4h时间点，6号亚群高表达fhuA（编码大肠杆菌羟肟酸铁蛋白摄取成分A）；9号亚群高表达secY（编码非特异性糖转运体）；10号亚群显著富集recA和sulA，（DNA损失修复相关、SOS反应调节因子）。9号亚群和10号亚群的代谢相关基因显著下调，但在6号亚群上调（图5o），表明低代谢活性可以产生ROS，这与9号亚群、10号亚群中的ROS降解基因低表达、SOS反应基因高表达相一致（图5n）。这些结果表明，大肠杆菌种群对高浓度AMP的反应不同。这种异质性被传统的混池RNA-seq测序忽略了，但可以被smRandom很好地识别。

图5、smRandom-seq鉴定了对氨苄西林反应不同的亚群

作者应用smRandom-seq方法分析了抗生素治疗下单个大肠杆菌的转录组变化，并发现了抗生素耐药亚群。该文章为科研工作者提供了一种新的方法，可以研究在压力下单个细菌如何适应，及与其他细菌互作。可以有效预测哪些亚群将进化出抗性并生存下来影响健康，并弄清楚细菌耐药性和持久性的机制，对细菌感染的精确诊断和治疗具有重要价值。smRandom-seq可以允许在单个细菌水平上监测细菌的转录组的变化，以进行高通量药物筛选。此外，smRandom-seq有望应用于揭示微生物群的异质转录组谱，识别稀有物种，以及破译在更不同的环境中的跨物种相互作用，例如肠道微生物群和土壤微生物群。

微生物单细胞转录组方法学文章的发表具有划时代意义，尤其是具有稳定优异性能的单细胞转录产品平台，为我们解锁神秘的微生物世界提供了一把金钥匙，浩瀚如海的微生物信息等待更多科研人员去挖掘。该文章中使用的M20 Genomics微生物单细胞转录组平台已经全面商业化，正在/有意开展微生物转录组研究的小伙伴们可以行动起来了，趁着蓝海还在，祝大家拿着新技术多发高分SCI。

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