Cell Stem Cell封面：中科院团队在猪体内“种”出人源肾脏！

2023-09-13 10:09

器官移植中供体短缺是一个普遍性的难题，目前还没有很好的解决方案。一种替代方案是通过胚胎补体技术生成包含人类组织的大型哺乳动物嵌合体。这个过程中可以利用基因编辑技术让特定器官缺失，从而创造出适合人类多能干细胞（PSCs）生长的位点，让 PSCs 填补空缺并促进器官的发育。

目前研究人员已经成功实现了小鼠和大鼠之间的器官嵌合，例如胰腺、胸腺和肾脏等。然而，由于跨物种的器官发育通常面临严重的挑战，在猪等大型哺乳动物中实现人类 PSCs 的有效嵌合仍然面临很大的挑战。尽管已经在猪胚胎中成功产生了人类内皮细胞和骨骼肌组织，但是由于人类 PSCs 在猪组织中的总体表现不佳，至今尚未生成实体器官。

为解决这个问题，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学、戴祯、Miguel A. Esteban 及潘光锦通过 PSCs 经过胚胎互补后在猪体内产生人源化中肾（mesonephros）。为了让人类细胞在异种环境中具备优越的内生生态位竞争力，研究人员将优化的 PSCs 培养条件与诱导过表达两种促生存基因（MYCN 和 BCL2）相结合。这些细胞在种间嵌合胚胎的异种环境中的生存能力显著提高，并且成功地在缺乏 SIX1 和 SALL1 基因的猪胚胎中形成有结构的人-猪嵌合中期肾，且维持到胚胎第 28 天。这项研究证明了在器官发生障碍的猪身上产生人源化原始器官的可能性，为再生医学提供了新的可能性，并且为研究人类肾脏发育提供了人工平台。

相关研究日前以“Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation”为题发表在《细胞·干细胞》上，并被作为封面文章。

突破器官移植瓶颈

人类和猪之间的免疫差异是器官移植中的一大挑战，而跨物种嵌合胚胎技术为解决这一难题提供了新的方向。然而该技术目前面临两个主要问题。首先，导出的人类多能干细胞与宿主细胞之间的竞争影响了嵌合的程度。其次，人类多能干细胞和宿主细胞之间的发育差异阻碍了它们的同步发育。

为了解决这些问题，研究人员正试图激活细胞内生存途径以促进嵌合。此外，他们还发现通过 MYCN 和 BCL2（N/B）的联合作用可以显著提高小鼠、兔子和猪嵌合胚胎的竞争能力。

除此之外，研究人员还开发了一种新的培养基 4CL，可以将人类 PSCs 逐步返回到早期发育阶段，从而实现人-鼠嵌合并促进跨物种类嵌合胚胎发展。SIX1 和 SALL1 基因分别调节肾脏早期中肾管的形成和发育及成熟的肾小管的分化和功能。作者认为，通过工程化改造 SIX1/SALL1 缺失的猪胚胎产生肾脏生态位缺陷，再向其中注入人类胚胎干细胞，可以让肾脏完整地发育。

培养具有优异嵌合潜力的多能干细胞

近期研究表明，人类多能干细胞的发育状态与嵌合体的形成有关。由于培养基能够影响人类多能干细胞的发育，本研究使用了常见的原始培养基 mTeSR1 以及几种原始培养基，包括最近报道的 4CL、商业化的 NHSM 基础上的 RSeT、PXGL 和 5iLA，并确定了 4CL 培养的多能干细胞与人类囊胚 E5 期最接近。因此，可以认为 4CL 培养的多能干细胞具有更高的嵌合胚胎形成能力。

接下来，作者筛选了一组条件，让注射了 DsRed 标记的诱导多能干细胞（iPSCs）的早期无精独配猪胚胎能够正常形成囊胚。最优的方案是将三到五个 iPSCs 注入到早期的猪胚囊胚或早期囊胚中，然后在由猪合子培养基（PZM）和 4CL 培养基以 1:1 比例混合成的培养基中培养。作者发现 4CL iPSCs 在囊胚阶段具有最高的嵌合能力。为提高嵌合能力，他们利用多西环素诱导系统在 4CL iPSCs 中过度表达 N/B，并观察到这种组合（4CL/N/B）产生了最高的嵌合能力。

研究人员选择 4CL/N/B iPSCs 及上述注射条件进行嵌合实验。为了观察嵌合胚泡内注射细胞的健康状态，他们进行了 TUNEL、Annexin V 染色，以及免疫染色。实验结果表明 4CL / N / B iPSCs 在猪胚泡内存活、增殖，与宿主细胞形成功能连接，并分化为早期胚胎和胚外谱系。

SIX1^-/- SALL1^-/-猪胚胎的肾缺损表型

通过基因工程产生器官缺陷的动物可以大大促进种间嵌合，因为它减少了特定组织生态位中的细胞竞争。SIX1 和 SALL1 在肾原基和肾芽中都有表达，并且对肾原基管形成和输尿管芽的入侵至关重要。为了产生肾缺损的猪胚胎，作者首先通过 CRISPR-Cas9 介导的猪胎儿成纤维细胞中外显子 1 的靶向，产生 SIX1^-/-胚胎，然后进行体细胞核移植（SCNT）。他们将 350 个 SIX1^-/- 胚胎移植到 3 只代孕母猪体内，这些胚胎在 E51 之前发育，最终获得了两只发育良好的胎儿，其肾芽发育不良、体积较小且具有缺陷。他们接着从这些胚胎中分离出成纤维细胞，进行了另一轮 SCNT，并将 4 只代孕母猪移植了 664 个 SIX1^-/- SALL1^-/-克隆胚胎，这些胚胎在 E35 之前发育。其中两个胚胎能够存活，但与野生型胚胎相比，其肾原基管数量明显减少，完全缺乏肾芽。

4CL/N/B 干细胞在肾缺损猪胚胎中的作用

确定了以 4CL/N/B iPSCs 进行胚泡补充的方案，并确认了 SIX1^-/- SALL1^-/- 猪胚胎中肾原基和肾芽发育受损后，作者研究了人类 PSCs 对肾脏发育的作用。他们向 13 只代孕母猪体内注射了总共 1820 个 DsRed+4CL/N/B iPSCs 的胚胎。考虑到克隆猪胚胎退化的高风险（峰值在大约 1 个月）和肾原基的出现时间（大约在 20 天后），代孕母猪的妊娠被终止于 E25 或 E28。这时间点大致对应人类的 E40，但两个物种的发育都不是线性的，例如人类肾原基在大约 25 天出现。对 E25 和 E28 的选择也出于伦理的考虑。研究团队在嵌合 E25 和 E28 胚胎中观察到强烈的红色荧光信号，与肾原基区域位置一致，而在未注射 4CL/N/B iPSCs 产生的野生型胚胎中未检测到信号。随后他们将这些胚胎嵌入石蜡中，并对整个半斜面切片进行 DsRed 免疫荧光染色。

在注射后的基因敲除胚胎中，大量的 DsRed 阳性细胞仅聚集于中肾区，在中肾小管中，约有 40 %-60 % 的 DsRed 阳性细胞。这些嵌合肾间叶组织呈现出与野生型胚胎类似的组织结构，进一步表明人类细胞对肾脏发育的贡献。

在缺乏肾组织的猪胚胎中成功生成人化中胚层

为了确认 4CL/N/B iPSCs 的嵌合性，研究团队采用基因组 PCR 测定法检测 DsRed 转基因，发现所有正常 E25 和 E28 胚胎均含有预期条带。用针对人类特异线粒体 DNA 序列的定量 PCR 测定法定量分析，发现整体细胞的比例范围为 1∶10000 至 1∶50000。另外，他们发现多数人类细胞核（h-nuclei）+ 细胞也是 DsRed+，而在野生型胚胎中未检测到信号。h-nuclei+ DsRed+ 细胞占嵌合胚胎中中胚层细胞的 50%～65%。对标志物的研究结果表明，4CL/N/B iPSCs 能够在宿主 SIX1^-/- SALL1^-/- 猪胚胎中分化成广泛的中胚层，如果延长代孕动物的妊娠时间，这些嵌合体有可能进一步发育成后肾组织。

人类细胞对其他细胞谱系的影响有限

通过胚胎补全技术在哺乳动物体内生成人类器官时，人类干细胞对神经和生殖细胞谱系的潜在影响是严重的伦理问题。因此，作者评估 4CL/N/B iPSCs 是否能分化为神经和生殖细胞，并分别通过与人特异性巢蛋白或 SSEA-1 共染色进行检测，这两种抗体分别标记神经特异性和生殖细胞特异性的细胞，并且与DsRed共染色。他们在大脑和脊髓中观察到极少数人巢蛋白 + DsRed+ 神经细胞。在生殖脊中未发现同时表达 DsRed 的 SSEA-1⁺细胞，表明 4CL/N/B iPSCs 没有分化为生殖细胞。DsRed+ 或 h-nuclei+ 细胞可见于其他各种组织（如肝脏和心脏），但数量也很少。

该研究的局限

作者展示了利用 iPSCs 在肾缺陷猪体内生成人源化中肾组织的方法。研究结果表明，通过物种间胚胎互补，可以在大型动物体内生成实体器官原基。然而，要让移植猪器官更好地存活并非易事，因为尽管进行了基因改造，免疫排斥反应仍未被消除。此外，物种间的生理学差异也可能导致功能障碍。

此外，还有一系列问题需要解决。首先，退化的猪胚胎的整体占比较高。而且由于迄今为止通过 SCNT 进行猪克隆的效率仍然很低，因此使用体外受精胚胎可能会提高注射胚胎的发育潜力。其次就是人类干细胞对包括大脑和生殖细胞在内的其他谱系的影响会引发严重的伦理问题。为了克服这一点，可以提前在供体人类 PSCs 中消除负责这些谱系发育的基因。这将有助于解决伦理问题，但也可能影响对肾脏的作用。第三，器官由多种细胞类型组成，包括对正常功能至关重要的血管细胞，如果其中任何细胞源自猪，则可能导致排斥反应。而抑制不同组织（如肾脏和内皮细胞）在猪体内的发育可能解决这个问题。

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来源: qq

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