蝙蝠作为第二大哺乳动物类群，也是唯一进化出真正自主飞行能力的哺乳动物，因具有长寿、抗病毒、冬眠和回声定位等生物学特性，而受到研究者的广泛关注。然而由于蝙蝠的生存环境特殊不易捕捉，且不具备实验室饲养的条件，目前仍缺少研究蝙蝠生物学的可靠细胞模型，因此很多关于蝙蝠的重复性试验无法开展。
诱导多能性干细胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 可以在体外进行自我更新, 高质量的 iPS细胞在适当的条件下还可以分化成不同类型的细胞及类器官，是细胞生物学研究的良好模型。然而，目前关于蝙蝠 iPS细胞的研究相对较少，已报道的蝙蝠iPS细胞存在外源诱导因子持续性表达的问题，且缺乏蝙蝠iPS细胞体内分化能力的相关检测。
早在2014年，中国农业大学吴森教授团队就率先制备了蝙蝠iPS细胞，而一直到2023年3月，根据美国纽约西奈山伊坎医学院赫芬顿帕金森病细胞研究中心的研究团队在杂志《Cell》上的报道，科研人员才开始尝试利用仙台病毒制备无外源基因整合的蝙蝠（野生大马蹄蝠和大鼠耳蝠）iPS细胞。
2023年9月5日, 来自中国农业大学和中国农业科学院的的吴森/杜旭光/余大为教授团队在Cell Discovery上发表题为Derivation of transgene-free bat induced pluripotent stem cells amenable to chimera formation in mice, pigs, and chicks 的文章，该研究利用episome非整合系统，在3i/LIF的培养体系中，获得了无外源基因残留的蝙蝠（小棕蝠）iPS细胞。这种蝙蝠iPS细胞表现出naïve-like多能性状态，且能够在鸡、小鼠和猪三种动物中实现不同比例的异种嵌合。之前的研究表明, 利用episome系统能够获得无外源因子残留的小鼠、大鼠和人的iPS细胞，这些iPS细胞均表现出高质量的自我更新状态和分化潜能。该研究采用八个重编程因子 (OCT4、SOX2、cMYC、KLF4、NANOG、LIN28、NR5A2和miR302/367 cluster) 的一元载体系统，在包含小分子抑制剂（PD0325901、CHIR99021和A8301）的3i/LIF培养基中高效率地获得了无外源因子残留的蝙蝠iPS细胞系。随后, 为了评估蝙蝠iPSCs的体内分化发育能力, 他们对蝙蝠iPS细胞进行了荧光标记，利用血管注射的方法评估蝙蝠iPS细胞在鸡胚中的嵌合能力。在孵化第6.5天，可以在鸡胚的头部和胸部观察到明显的绿色荧光，免疫荧光染色结果证实蝙蝠iPS细胞在鸡胚中可以分化为三胚层细胞。本报道最终获得了两只出生的嵌合体雏鸡，在雏鸡的大脑位置可以观察到明显的绿色荧光。免疫荧光染色结果显示，蝙蝠iPS细胞在嵌合体雏鸡大脑中可分化为神经类细胞。以上结果表明，蝙蝠iPS细胞能够在鸡胚中进行有效嵌合, 并分化为功能性神经元细胞。除此之外，该研究还评估了蝙蝠iPS细胞在小鼠、猪两种模式哺乳动物中的嵌合能力。通过囊胚注射的方法，他们制备了蝙蝠/小鼠和蝙蝠/猪的异种嵌合体。实验结果显示, 在小鼠和猪的植入前胚胎中，蝙蝠iPS细胞均表现出较高的嵌合能力, 并对内细胞团 (Inner cell mass, ICM) 有贡献。将蝙蝠/小鼠嵌合囊胚移植入代孕鼠后，对发育至8.5天的胚胎进行嵌合比例的分析，结果显示3/17的小鼠胚胎嵌合比例达到1/1000；对发育至10.5天的小鼠胚胎进行三胚层特异标记基因的免疫荧光染色分析，结果发现蝙蝠iPS细胞在嵌合小鼠胚胎中可以发育分化为三胚层细胞。将蝙蝠/猪的嵌合囊胚移入受体母猪后, 对第25-27天的嵌合胚胎进行检测。结果发现，11/39的胚胎嵌合比例超过1/10,000，且嵌合胚胎中蝙蝠iPS细胞能够分化为所有三个胚层的细胞。以上结果表明，蝙蝠iPS细胞在小鼠和猪的植入前胚胎中均表现出较高的嵌合能力, 且能够向三胚层分化。图 构建具有小鼠、猪和小鸡体内分化潜力的无转基因的蝙蝠iPS细胞a诱导载体pMaster12的示意图，其中包括8个重编程因子和正负筛选标记。b biPSCs的代表性图像；比例尺，1000 µm。c PCR结果显示biPSC-68和biPSC-70不含pMaster12的载体序列。GAPDH作为内参基因，pMaster12质粒作为阳性对照。d BEFs、transgene-biPSCs和transgene-free biPSCs基因表达的树状图聚类图。e 嵌合体制备示意图：transgene-free biPSCs在小鼠、猪和鸡中生成异种嵌合体的流程图。f D6.5蝙蝠/小鸡嵌合胚胎的头部/胸部GFP荧光的代表性图像。比例尺，1 mm。g D9.5蝙蝠/小鸡嵌合胚胎头部GFP荧光的代表性图像。比例尺，1 mm。h 出生后3天的蝙蝠/小鸡嵌合体大脑GFP的代表性图像。比例尺，1 mm。i 嵌合体小鸡（#1和#2）中蝙蝠mtDNA的定量检测结果。用蝙蝠和小鸡体细胞的梯度稀释样本作标准曲线。蓝线表示蝙蝠mtDNA检测水平（每10,000个小鸡细胞中有1个蝙蝠细胞）。j 蝙蝠/小鸡嵌合体（＃2）头部的代表性免疫荧光染色图像。白色箭头指示同时表达GFP和神经类标记基因（GALBINDIN、HB9、CHAT、BRN3A、IRX3、S100β）的细胞。比例尺，50 μm。k 蝙蝠/小鼠嵌合胚胎中蝙蝠mtDNA的定量检测结果。蓝线表示蝙蝠mtDNA检测水平（每10,000个小鼠细胞中有1个蝙蝠细胞）。l biPSCs在小鼠胚胎中进行三胚层分化的代表性免疫荧光染色图。白色箭头指示同时表达GFP和三胚层标记基因（α-SMA、GATA4、SOX9）的细胞。比例尺，50 µm。m 蝙蝠/猪嵌合胚胎（E25）中蝙蝠mtDNA的定量检测结果。蓝线表示蝙蝠mtDNA检测水平（每10,000个猪细胞中有1个蝙蝠细胞）。n biPSCs在猪胚胎中进行三胚层分化的代表性免疫荧光染色图。白色箭头指示同时表达GFP和三胚层标记基因（α-SMA、GATA4、SOX9）的细胞。比例尺，50 µm。
综上所述，该研究构建了一种无外源基因整合的蝙蝠iPS细胞，这些蝙蝠iPS细胞在小鼠、猪和鸡三种模式动物中均表现出较好的体内嵌合能力。其中, 在蝙蝠/鸡异种嵌合体中获得了高比例的嵌合, 提示鸡胚可以作为外源干细胞嵌合能力检测的有效受体。无外源基因整合的蝙蝠iPS细胞质量更高，不具有谱系分化偏好，避免了嵌合后代的肿瘤形成和死亡的风险，且为制备蝙蝠类器官提供了高质量的原材料。该细胞系的建立将为以蝙蝠作为实验材料的长寿、抗病毒防御和回声定位等机制研究提供优质的细胞资源。中国农业大学生物学院秦毓敏博士和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所李崇阳博士为本文的共同第一作者。中国农业大学生物学院吴森、杜旭光，以及中国农业科学院北京畜牧兽医研究所余大为研究员为本文的共同通讯作者。团队开发的无外源基因残留的蝙蝠iPS细胞技术已经申报专利。https://www.nature.com/articles/s41421-023-00587-3
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